黃芩素可增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性及其與PI3K-Akt-NF-κB信號通路的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　為了研究黃芩素對人肺癌細(xì)胞A549耐順鉑株（A549/CDDP）的順鉑細(xì)胞毒性的影響并探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1. MTT法測定腫瘤細(xì)胞的增殖能力。
　　2.采用Annexin V/PI雙染法檢測A549/CDDP的細(xì)胞凋亡情況。
　　3. Transwell法檢測A549和A549/CDDP細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化。
　　4.采用westen blot法測定各蛋白E-ca

2、dherin、Vimentin、p-Akt、Akt、p65、IκBα、c-IAP1, c-IAP2, survivin和Bcl-xL的表達(dá)水平。
　　5. siRNA沉默A549/CDDP細(xì)胞中p65的表達(dá)，降低NF-κB的活性。
　　6.采用腫瘤動物模型觀察黃芩素對順鉑細(xì)胞毒性的影響。
　　7.統(tǒng)計學(xué)：本實驗所有數(shù)據(jù)均使用SPSS16.0軟件進(jìn)行q檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.黃芩素通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增強(qiáng)順鉑

3、的細(xì)胞毒性作用
　　黃芩素濃度為200μM時對A549/CDDP細(xì)胞有抑制作用，選取100μM黃芩素與順鉑合用后測細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠明顯增強(qiáng)順鉑對A549/CDDP的細(xì)胞毒性。Annexin V/PI雙染法檢測后發(fā)現(xiàn)：黃芩素與順鉑合用后能夠明顯增加細(xì)胞的凋亡。
　　2.動物模型中，黃芩素可增強(qiáng)順鉑細(xì)胞毒性
　　腫瘤動物模型建立后，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單用順鉑或者黃芩素組相比較，黃芩素與順鉑聯(lián)合用藥能夠顯著降低裸鼠

4、體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增長。
　　3. A549/CDDP細(xì)胞發(fā)生了EMT
　　結(jié)果顯示：與 A549細(xì)胞相比，A549/CDDP細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了 EMT轉(zhuǎn)變， E-cadherin表達(dá)明顯降低，Vimentin表達(dá)顯著上升，A549/CDDP細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯提高。說明A549耐順鉑株發(fā)生了EMT。
　　4.黃芩素可逆轉(zhuǎn)A549/CDDP細(xì)胞的EMT
　　用黃芩素處理 A549/CDDP細(xì)胞后，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃芩

5、素可顯著降低A549/CDDP細(xì)胞的侵襲、遷移能力，并且能上調(diào)A549/CDDP細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，降低Vimentin的蛋白表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)A549/CDDP細(xì)胞EMT。
　　5.黃芩素逆轉(zhuǎn)A549/CDDP細(xì)胞EMT與PI3K/Akt信號通路有關(guān)
　　實驗結(jié)果顯示：與A549細(xì)胞相比，A549/CDDP細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)明顯增強(qiáng)，使用LY294002處理A549/CDDP后可抑制p-Akt的表達(dá)，阻斷PI

6、3K/Akt信號通路,且能上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，降低Vimentin的表達(dá)，降低A549/CDDP細(xì)胞的侵襲、遷移能力，并增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性。而黃芩素隨著濃度的增加可逐漸降低p-Akt的表達(dá)水平，這些結(jié)果說明在A549/CDDP細(xì)胞中黃芩素可以抑制PI3K/Akt信號通路的活性，從而逆轉(zhuǎn)EMT，增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性作用。
　　6.黃芩素逆轉(zhuǎn)EMT、增強(qiáng)順鉑細(xì)胞毒性與抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路有關(guān)
　　實

7、驗結(jié)果證明：與A549細(xì)胞相比，A549/CDDP細(xì)胞中p65表達(dá)增高，IκBα的表達(dá)下降。siRNA沉默p65蛋白表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，E-cadherin的表達(dá)增加而Vimentin表達(dá)降低，且細(xì)胞的侵襲、遷移能力降低，MTT法測得順鉑的細(xì)胞毒性增加，說明降低NF-κB活性可逆轉(zhuǎn)EMT。而western blot顯示黃芩素可降低p65的表達(dá)水平同時上調(diào)IκBα的表達(dá)水平，而LY294002阻斷信號通路后也可降低NF-κB的活性。因此我們得出黃

8、芩素抑制 EMT，增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性的能力可能是通過調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB信號通路來實現(xiàn)的。
　　7.黃芩素能夠抑制NF-κB下游靶蛋白的活性
　　western blot檢測結(jié)果顯示：黃芩素能夠明顯降低NF-κB所調(diào)控的靶蛋白包括抗凋亡蛋白c-IAP1, c-IAP2, survivin和Bcl-xL的表達(dá)。
　　結(jié)論：黃芩素能夠在體內(nèi)及體外增加A549/CDDP細(xì)胞對順鉑的敏感性，其機(jī)制可能是通過阻斷細(xì)胞