α7nAChR在尼古丁對人牙周膜干細胞成骨分化負性調控中的作用及其機制研究.pdf

1、牙周炎是口腔常見病,是成人牙齒喪失的主要原因之一。吸煙是牙周炎的重要危險因素。在煙草的毒性物質中,煙堿即尼古丁是其主要成分,為生物堿。吸煙者較不吸煙者牙周炎的患病率高、病情重。大量研究表明:吸煙與牙周袋形成、附著喪失、骨喪失及牙齒喪失有關。
　　牙周炎的發(fā)生發(fā)展存在牙周組織破壞和再生修復兩種相互交替的過程,而尼古丁對牙周炎的影響也在于加速牙周組織破壞抑制再生修復從而使得較之于非吸煙者而言,吸煙者的病情更加嚴重。同時,尚可使吸煙者經

2、系統(tǒng)性牙周治療的預后較差。目前對于尼古丁相關性牙周炎的研究主要集中于對牙周組織的破壞層面,對于其抑制再生修復的原因及機制,鮮有文章報道。
　　牙周膜組織中存在具有形成細胞克隆能力的牙周膜干細胞(PDLSC)。牙周膜干細胞具有干細胞的基本特性,在成骨誘導條件下有向成骨方向分化的特定趨勢;實驗性大鼠牙周炎動物模型證實,PDLSC能在體內形成具有牙周膜-牙骨質復合體樣的結構伴穿通纖維走行其中,因此人牙周膜干細胞具有修復牙周缺損和形成牙周

3、新附著的潛能。
　　本課題體外研究尼古丁對PDLSC成骨能力的影響,檢測PDLSC是否表達尼古丁特異性受體α7nAChR并探討此受體及其下游信號通路是否參與尼古丁對PDLSC成骨分化的負性調控作用。以期完善尼古丁對牙周炎不良影響的作用機制,為臨床治療新途徑提供實驗依據。
　　實驗一:人牙周膜干細胞分離培養(yǎng)和鑒定
　　本實驗采用有限稀釋法對PDLSC進行分離培養(yǎng),流式細胞儀檢測其表面抗原標志物;同時給予一定誘導微環(huán)境,觀

4、察其定向分化潛能,以期為后續(xù)實驗提供理想的種子細胞。結果提示:有限稀釋法可自人牙周膜細胞中成功提純hPDLSC克隆,所得細胞陽性表達間充質來源干細胞表面分子抗原標志物且在一定誘導微環(huán)境下具有成骨和成脂分化潛能。說明所得細胞具有干細胞基本特性,來源可靠。
　　實驗二:尼古丁對人牙周膜干細胞形態(tài)和增殖能力的影響
　　本實驗體外培養(yǎng)PDLSC,分別給予梯度濃度尼古丁,觀察一定作用時間后細胞形態(tài)和增殖能力的改變,為后續(xù)實驗摸索適宜的

5、尼古丁作用濃度。結果提示:不同濃度尼古丁均可對細胞形態(tài)產生影響并抑制PDLSC增殖能力,且尼古丁對細胞增殖能力的抑制呈濃度依賴性。說明尼古丁對PDLSC具有細胞毒作用,合適的作用濃度是開展后續(xù)體外實驗的必要條件。
　　實驗三:尼古丁對人牙周膜干細胞成骨分化能力的影響
　　本實驗觀察了尼古丁對PDLSC成骨分化能力的影響,以期解釋吸煙者牙周再生情況較差的原因,為臨床治療提供理論依據。結果提示:不同濃度尼古丁均可抑制PDLSC早

6、期和終末期成骨分化且具有濃度依賴性。尼古丁可抑制成骨相關因子ALP、BSP、OCN和Runx2基因及蛋白的表達。說明其對PDLSC成骨分化具有負性調控作用。
　　實驗四:α7nAChR在PDLSC中的表達及其所介導的尼古丁對細胞成骨的負性調控作用
　　本實驗旨在探討PDLSC中α7nAChR的表達并進一步明確該受體是否介導尼古丁對PDLSC骨向分化的負性調控作用。結果提示:PDLSC中存在α7nAChR基因和蛋白的表達;組織

7、學染色進一步證實通過給予α-BTX競爭性拮抗尼古丁與受體的結合,可在一定程度逆轉尼古丁的負性調控效應?；蚝偷鞍捉Y果提示當尼古丁同受體的結合被拮抗后,PDLSC成骨相關基因和蛋白的表達同尼古丁作用組相比也出現(xiàn)上調。說明PDLSC中存在α7nAChR介導的尼古丁對PDLSC成骨的負性調控作用。
　　實驗五:Wnt信號通路在尼古丁影響人牙周膜干細胞成骨能力中的作用
　　本實驗旨在探討尼古丁同α7nAChR結合后下游是否存在Wnt

8、信號通路的表達變化并進一步明確該通路是否參與了尼古丁對PDLSC骨向分化的負性調控作用。結果提示α7nAChR激活后下游存在Wnt信號通路相關轉錄因子蛋白的表達變化;組織學染色進一步證實Wnt信號通路抑制劑Dkk1可在一定程度逆轉尼古丁對PDLSC成骨的負性調控。基因和蛋白結果提示當Wnt信號通路被抑制后,PDLSC成骨相關基因和蛋白的表達同尼古丁作用組相比也出現(xiàn)上調。說明α7nAChR下游存在Wnt信號通路的激活且在PDLSC中Wnt