Smoothened(smo)對人牙周膜干細胞應(yīng)力成骨作用的實驗性研究.pdf

1、矯治性牙位移動過程中,牙槽骨的應(yīng)力改建過程主要是以破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細胞介導(dǎo)的骨形成相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。其中張應(yīng)力區(qū)中所發(fā)生的由成骨細胞介導(dǎo)的骨形成是錯位牙矯治性定向移動中安全和穩(wěn)定的根本保證。人牙周膜干細胞(PDLSCs)是一群來源于人牙周膜組織,具有多項分化潛能的干細胞,被認為是進行牙周組織修復(fù)與再生的理想的種子細胞。已有研究認為,PDLSCs是正畸牙移動過程中骨改建過程的關(guān)鍵細胞。力學(xué)刺激作用于該細胞,信號傳遞是通過胞外基質(zhì)傳

2、導(dǎo)至胞漿引起一系列細胞內(nèi)的生物學(xué)變化,從而觸發(fā)牙槽骨的應(yīng)力改建,最終實現(xiàn)了牙齒的定向移動。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn):體外培養(yǎng)的PDLSCs中具有Hh信號通路的表達,并且該信號通路參與了PDLSCs的應(yīng)力成骨過程。
　　Hedgehog信號通路在哺乳動物多器官的正常發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用,具有調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡的能力。研究證實,在胚胎發(fā)育軟骨內(nèi)成骨的過程中,Hedgehog信號通路通過細胞表面受體與配體PTCH或SMO競爭性結(jié)合而激

3、活,從而誘導(dǎo)MSCs向成骨細胞分化。同時研究表明,Hedgehog信號通路在牙胚發(fā)育過程中起關(guān)鍵性的作用,介導(dǎo)了牙胚發(fā)育早期上皮與間充質(zhì)之間、上皮與上皮之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年來研究提示,Hedgehog信號通路促進了PDLSCs的增殖過程。根據(jù)已有研究,Hedgehog信號通路的激活會促進MSCs的增殖并調(diào)控MSCs的成骨分化,同時適宜的力學(xué)刺激更能有效提高MSCs的細胞活性并增強其功能。但是,在PDLSCs應(yīng)力成骨過程中Hedgehog

4、信號通路的調(diào)控機制如何尚未得以證實。Smoothened(SMO)是Hh信號通路中的重要受體蛋白,負責Hh的信號傳導(dǎo)和靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而激活該信號通路。因此,本實驗利用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA過表達及干擾技術(shù)調(diào)節(jié)PDLSCs中SMO的表達,研究分析SMO在應(yīng)力作用下對PDLSCs成骨分化的影響。為進一步研究SMO基因的功能及靶向調(diào)控PDLSCs應(yīng)力作用下的成骨分化奠定實驗基礎(chǔ),以期待進一步揭示矯治性牙位移動過程中牙槽骨應(yīng)力條件下的改建機制

5、。
　　目的:
　　體外構(gòu)建及篩選人SMO基因的慢病毒過表達及干擾載體,使用此載體調(diào)節(jié)PDLSCs中SMO基因的表達并檢測其在應(yīng)力作用下對PDLSCs成骨分化的影響。
　　方法:
　　1、人牙周膜干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定:
　　PDLSCs來源于臨床上12—24歲之間因正畸需要或阻生而拔除的牙體牙周均健康的新鮮牙齒,并經(jīng)知情同意。用含1％雙抗的PBS反復(fù)沖洗,冠根單向刮取牙根中1/3的牙周膜,采用酶消化組織塊

6、法聯(lián)合培養(yǎng),48h后首次換液,后每3d換液,細胞融合至80﹪時傳代,經(jīng)流式細胞分選獲得PDLSCs,經(jīng)鏡下觀察細胞形態(tài)及其克隆形成能力;免疫組化檢測其角蛋白及波形蛋白表達;流式細胞術(shù)分析其細胞表面標志物STRO-1、CD146;成骨、成脂誘導(dǎo)分化試驗等進行干細胞特性鑒定。
　　2、慢病毒感染:
　　PDLSCs分別被攜帶SMO特異性過表達、RNAi的慢病毒感染,通過real-timePCR、Westernblot檢測PDLS

7、Cs中SMO基因的表達。實驗分四組,包括由攜帶SMO特異性過表達慢病毒感染的PDLSCs/SMO-過表達組、由攜帶SMO特異性RNAi慢病毒感染的PDLSCs/SMO-RNAi組、由空慢病毒感染的PDLSCs/vector組和正常細胞對照PDLSCs/wt組。
　　3、細胞應(yīng)力加載:
　　.將第4—6代PDLSCs的四組細胞分別種于BioFlex專用加載六孔培養(yǎng)板(硅膠模制孔底)內(nèi),通過國際標準化水平的加力裝置FX-4000

8、T加載動態(tài)張應(yīng)力,加力方式為最大形變量12%,最小型變量為0的正弦波,頻率0.1Hz(5s拉伸5s放松),加力時間為0h(只在BioFlex板中靜置培養(yǎng))、6h、12h、24h,加力完畢后收集細胞,通過Westernblot檢測PDLSCs相關(guān)成骨標志物Runx2、ALP的表達變化,以及Hh信號通路相關(guān)效應(yīng)蛋白SMO、GLI1、PTCH1的表達變化。
　　結(jié)果:
　　1、原代培養(yǎng)的PDLCs增殖快,單個細胞有2-4個突起,長

9、梭形或不規(guī)則形;通過流式細胞術(shù)細胞抗體STRO-1分選所得PDLSCs陽性率為41.7%,其與PDLCs形態(tài)相似,體積略小,成旋渦狀或放射狀排列,細胞具有克隆形成能力;免疫組化檢測顯示PDLSCs角蛋白表達陰性,波形蛋白表達陽性,說明所得PDLSCs來源于中胚層;流式細胞術(shù)檢測顯示PDLSCs高表達間充質(zhì)干細胞標志STRO-1和CD146;經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21天后鏡下可見礦化結(jié)節(jié)形成,茜素紅染色陽性;成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)21天后可見脂滴形成,

10、油紅O染色陽性,說明PDLSCs具有成骨、成脂等多向分化能力。
　　2、定量PCR檢測轉(zhuǎn)染過表達病毒后PDLSCs中SMO基因的轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染過表達病毒的PDLSCs中SMO基因轉(zhuǎn)錄水平增加明顯,達未轉(zhuǎn)染細胞的15倍,從而成功在PDLSC細胞中獲得了SMO基因的外源性表達
　　3、westernblot檢測結(jié)果顯示慢病毒干擾載體能夠在蛋白水平有效的下調(diào)目的蛋白SMO的表達,表達量降低80%(干擾組灰度值0.22±

11、0.04vs對照組灰度值1.15±0.13,p<0.01)。
　　4、通過FX-4000T應(yīng)力加載系統(tǒng)對四組PDLSCs進行同一加載方式、不同時間段的應(yīng)力加載后檢測相關(guān)蛋白的表達發(fā)現(xiàn):
　　(1)PDLSCs/wt組加力后,ALP、Runx2的表達水平較未加力時上調(diào),說明應(yīng)力刺激能促進PDLSCs的成骨分化。
　　(2)PDLSCs/wt組加力后,Hedgehog家族中的膜受體PTCH1、SMO、核心轉(zhuǎn)錄因子GLI1及

12、成骨標志物ALP、Runx2的表達均較未加力時升高,說明Hh信號對力學(xué)刺激敏感且參與了PDLSCs的成骨分化。
　　(3)PDLSC/SMO-RNAi組與PDLSCs/wt組比較,在加力早期(0-6h)PDLSC/SMO-RNAi組細胞ALP、Runx2的表達較PDLSCs/wt組低,但是隨著加力時間的延長(6-12h),PDLSC/SMO-RNAi組細胞ALP、Runx2的表達仍有升高趨勢,這一結(jié)果提示,SMO基因與PDLSCs

13、應(yīng)力成骨過程密切相關(guān),同時Hh信號并非是應(yīng)力促進PDLSCs成骨分化的唯一途徑,應(yīng)力刺激還可以通過其他通路或因子促進PDLSCs的成骨分化。
　　(4)PDLSCs/wt組、PDLSC/SMO-過表達組、PDLSC/SMO-RNAi組應(yīng)力加載后,ALP、Runx2的表達量均在12h時升高最明顯,說明應(yīng)力刺激12h時具有較強的促成骨分化作用。
　　(5)PDLSCs/wt和PDLSC/SMO-過表達組在加力的早期(0-12h)

14、ALP、Runx2的表達量逐漸增加,在加力晚期(12-24h)ALP、Runx2的表達量逐漸降低,這一趨勢也提示Hedgehog信號通路對成骨分化的作用:早期表現(xiàn)為促進,而晚期表現(xiàn)為抑制。
　　(6)在不同的時間段,PDLSC/SMO-過表達組ALP、Runx2的表達均比PDLSCs/wt及PDLSC/SMO-RNAi組細胞顯著,說明SMO基因?qū)DLSCs成骨分化的促進作用明顯。
　　結(jié)論:
　　1、從人牙周膜組織中

15、分離培養(yǎng)并經(jīng)流式細胞儀分選得到的PDLSCs在體外具有一定的克隆形成能力,且細胞表面分子表達情況與文獻報道一致,并在誘導(dǎo)環(huán)境下表現(xiàn)出明顯的分化潛能,具有成體干細胞特性。
　　2、PDLSCs被攜帶SMO特異性過表達及SMO特異性RNAi慢病毒感染后,其SMO基因可呈現(xiàn)穩(wěn)定的高或低表達。
　　3、通過對各組細胞進行應(yīng)力加載試驗后檢測相關(guān)蛋白指標提示:Hh信號對力學(xué)刺激敏感且參與了PDLSCs應(yīng)力作用下的成骨分化;力學(xué)刺激12h