人牙周膜干細胞成骨分化相關lncRNAs的篩選及鑒定.pdf

1、本論文主要包括以下四章內容:
　　第一章 人牙周膜干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定
　　本章實驗采用改良酶組織塊法及有限稀釋法分離純化hPDLSCs，CCK8法檢測并繪制細胞生長曲線，利用流式細胞儀檢測細胞表面分子標記物，采用單克隆形成實驗和多向誘導實驗分別檢測細胞的克隆形成能力及多向分化潛能。
　　第二章 基因芯片檢測人牙周膜干細胞成骨分化相關lncRNA及其驗證
　　采用基因芯片技術對成骨誘導14 d及對照組hPDLS

2、Cs的RNA提取物進行檢測，分析成骨誘導前后hPDLSCs中mRNA及l(fā)ncRNA的表達水平變化情況，利用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)技術對基因芯片的檢測結果進行驗證。
　　第三章 人牙周膜干細胞成骨誘導前后lncRNA-mRNA共表達譜的構建及關鍵lncRNA的篩選
　　利用基因本體論(gene ontolo

3、gy，GO)、路徑分析(pathway analysis)等生物信息學方法對基因芯片結果進行初步的分析，采用編碼-非編碼-基因共表達（coding-noncoding gene co-expression，CNC）網絡分析技術構建lncRNA與mRNA之間的調控網絡圖譜，根據分析結果篩選出在hPDLSCs成骨分化過程中的關鍵lncRNA; qRT-PCR檢測關鍵lncRNA在hPDLSCs成骨誘導前后及牙周膜組織中的表達水平。
　

4、　第四章 抑制TCONS_00007046表達對人牙周膜干細胞成骨分化的影響
　　構建lncRNA TCONS_00007046 shRNA慢病毒并進行細胞轉染，利用qRT-PCR檢測慢病毒抑制效率，CCK8法檢測抑制TCONS_00007046表達對hPDLSCs增殖能力的影響。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性染色及茜素紅S染色檢測成骨誘導14 d后檢測抑制TCONS_00007046表達對hP

5、DLSCs成骨分化的影響，并利用qRT-PCR法檢測成骨相關基因（ALP、OCN、Runx2、BMP2及BMP6）表達水平變化。
　　材料方法：
　　組織獲取及細胞培養(yǎng)
　　實驗中所用離體牙取自南方醫(yī)院口腔頜面外科門診18～25歲患者因阻生需要拔除的健康、完整的第三磨牙（經患者知情同意）。所選患者無其他系統(tǒng)性疾病史、吸煙或特殊用藥史。牙齒拔除后迅速置于含雙抗的α-MEM培養(yǎng)液中，放入冰盒內送入實驗室。在超凈臺內輕輕刮取

6、牙根中1/3的牙周膜組織，PBS緩沖液中反復漂洗。用眼科剪將組織小心地剪碎成1 mm×1mm×1mm大小，置于3 mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4mg/mL的中性蛋白酶混合液中，37℃水浴消化30min。加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，800 rpm離心3 min，小心棄去上清，并加入少量完全培養(yǎng)基，用槍頭輕輕吹打均勻，使細胞懸液與松散組織呈混勻狀態(tài)，接種至6孔板內鋪平，加蓋玻片于組織塊之上并加入適量含有10％胎牛血清、100μmol/L磷酸鹽抗

7、壞血酸、2mmol/L谷氨酸鹽、100 U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液，于5％CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)，每2～3 d換液。
　　取第1代人牙周膜細胞，胰酶消化制成細胞懸液，并利用逐步稀釋法將細胞濃度調整為10～15個/mL。按100μL/孔的密度將細胞接種于96孔板中，5％CO2、37℃環(huán)境培養(yǎng)12 h后，在倒置顯微鏡下進行觀察，標記出僅含單個細胞的孔并加培養(yǎng)液至20μL，每2～3 d換液，當單細胞生長匯

8、合至70～80％時消化傳代。CCK8實驗
　　取第3代生長狀態(tài)良好的hPDLSCs，以2×103個/孔的密度（約100μL/孔細胞懸液）接種于96孔板中，5％ CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，向每孔內加入10μL CCK8溶液，“十”字法混勻后避光培養(yǎng)1～4h，然后用多功能酶標儀檢測490 nm波長下各孔的OD值，并取平均值繪制生長曲線。
　　流式細胞術檢測細胞表面分子標記物
　　取第3代處于對數生長期的hPD

9、LSCs，以1×106個/mL的密度重懸于預冷的PBS緩沖液中。以小鼠抗人PE示記的CD146、CD29、CD31、CD34、CD90抗體及APC標記Stro-1抗體，冰上遮光孵育1h。預冷的PBS緩沖液清洗2～3次后，上流式細胞儀檢測表面分子標記物。
　　克隆形成率檢測
　　取第3代細胞，以1×102個皿的密度接種于100 mm直徑的培養(yǎng)皿中。置于5％ CO2、37℃環(huán)境培養(yǎng)箱內培養(yǎng)14d后，棄去原培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗

10、后，用4％的多聚甲醛固定細胞，結晶紫染色劑染色，倒置顯微鏡下觀察單克隆形成情況（以≥50個細胞為一個克隆），并計算細胞克隆形成率。
　　多向分化能力檢測
　　取第3代生長狀態(tài)良好的細胞，以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，待細胞生長至80％匯合時，棄去原培養(yǎng)液，并分別加入成骨、成脂誘導液，每3d換液。連續(xù)培養(yǎng)21d后，分別用2％茜素紅S、油紅O染色劑染色，顯微鏡下觀察。
　　RNA提取與基因芯片檢測
　　對第

11、3代hPDLSCs進行成骨誘導，對照組常規(guī)培養(yǎng)，分別提取培養(yǎng)14 d后兩組細胞的總RNA，Trizol法提取細胞內總RNA。NanoDropND-1000紫外分光光度計檢測其濃度與純度，分別進行l(wèi)ncRNA和mRNA表達譜基因microarray芯片檢測，每組檢測重復分別3次。
　　實時熒光定量PCR檢測
　　提取細胞總RNA，檢測其純度和濃度，逆轉錄成cDNA后，SYBR Green法進行PCR擴增，以GADPH作為內參基

12、因，以2-ΔΔCt值代表基因的相對表達強度。
　　生物信息學分析
　　利用基因芯片結果，綜合數據庫資源，利用聚類分析、GO分析、pathway分析等生物信息學方法，對基因芯片的檢測結果進行初步的分析，以P值大小作為顯著性判斷標準，P＜0.05時認為數據具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.人牙周膜干細胞細胞生物學特性觀察
　　本實驗采用改良酶組織塊法及有限稀釋法分離獲得hPDLSCs，成骨及成脂誘導實驗證明

13、其有多向分化能力，克隆形成實驗檢測其具有克隆形成能力。流式檢測結果顯示，細胞陽性表達間充質干細胞表面分子標記物CD29(99.62％)，CD90(97.13％)， CD146(10.27％)和Stro-1(12.76％);陰性表達造血干細胞分子標記物CD31(0.07％)和CD34(0.22％)。
　　2.成骨誘導前后lncRNA及mRNA差異表達情況
　　基因芯片檢測結果顯示，hPDLSCs成骨誘導后共有994個lncRN

14、A出現(xiàn)上調表達，1177個下調表達;共有3557個mRNA在成骨誘導后出現(xiàn)差異表達，其中1578個上調，1979個下調（變化倍數＞2.0或＜-2.0，P＜0.05）。挑選lncRNA及mRNA進行qRT-PCR驗證，其結果與芯片檢測結果基本吻合。
　　3.lncRNA-mRNA共表達譜構建及關鍵lncRNA的挑選
　　GO分析結果示，出現(xiàn)差異表達的mRNA與細胞生理過程、生物調節(jié)等多個過程存在顯著相關性;Pathway分析示

15、共有83條信號通路參與了hPDLSCs成骨分化過程，包括MAPK、VEGF及TGF-β等通路。挑選成骨相關mRNA(ALP、BMP6、COL1A1、COL1A2、IL6、BMP5及BMP2)作為靶基因進行CNC分析并構建lncRNA-mRNA共表達圖譜，顯示共有131對lncRNA及mRNA之間存在負相關，有262對正相關。對檢測結果進行分析，挑選出TCONS_00007046作為進一步研究對象，qRT-PCR對其表達進行驗證顯示該基因

16、在PDL組織及hPDLSCs細胞內均存在表達，且成骨誘導后變化趨勢與基因芯片結果具有一致性。
　　4.抑制TCONS_00007046表達對人牙周膜干細胞成骨分化、增殖的影響
　　本實驗成功構建TCONS_00007046 shRNA慢病毒載體，并利用qRT-PCR檢測其抑制效率。CCK8法檢測結果顯示抑制TCONS_00007046表達對hPDLSCs增殖不產生影響。ALP活性染色檢測結果顯示，對細胞進行14 d的成骨誘導

17、后，TCONS_00007046表達抑制的hPDLSCs細胞中的ALP活性較低。茜素紅S染色結果亦顯示，TCONS_00007046表達抑制組細胞礦化結節(jié)形成量較對照組細胞少。qRT-PCR法檢測結果顯示，抑制TCONS_00007046表達時，成骨相關mRNAALP、OCN、Runx2、BMP2及BMP6的表達水平降低。
　　結論：
　　(1)本實驗利用有限稀釋法分離培養(yǎng)出人牙周膜干細胞，具有在體外克隆形成及成骨、成脂向分

18、化的能力。(2)在人牙周膜干細胞及其成骨分化過程中均存在大量lncRNA的顯著差異表達。(3)生物信息學初步分析結果顯示，lncRNA在人牙周膜干細胞成骨分化過程中發(fā)揮著調控作用，其可能與成骨相關基因的表達有關，且該調控過程可能有多條信號通路的參與。(4)lncRNATCONS_00007046對hPDLSCs的增殖不產生影響，抑制TCONS_00007046表達時，hPDLSCs的成骨能力受到抑制，且該調控過程可能與成骨相關mRNA