蛇床子素通過表觀遺傳修飾改善炎癥來源牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的研究.pdf

1、目前已經(jīng)普遍認(rèn)為牙周炎通過破壞牙周支持組織從而導(dǎo)致成人牙齒缺失[1]。在口腔醫(yī)療領(lǐng)域，醫(yī)生們致力于牙周炎的治療及牙周缺損的修復(fù)。臨床治療中常見的牙周治療為齦上潔治術(shù)、齦下刮治術(shù)、翻瓣術(shù)等等[2]。同時，在科研領(lǐng)域，學(xué)者們致力于對牙周炎發(fā)生機(jī)制的探討。2013年孔祥偉等發(fā)現(xiàn)在牙周炎來源牙周膜干細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）通過促進(jìn)GSK3β磷酸化從而激活Wnt/β-catenin通路抑制細(xì)胞成骨[3]。此外，在組織工程領(lǐng)域，學(xué)者們也

2、運(yùn)用各種手段構(gòu)建細(xì)胞膜片或材料修復(fù)牙周炎產(chǎn)生的牙槽骨缺損。2014年徐秋等將富含血小板血漿添加至牙周膜干細(xì)胞膜片中提高其促進(jìn)骨修復(fù)的能力[4]。上述研究表明了，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)τ谘乐苎椎闹匾曇约捌渚薮蟮难芯績r值。
　　在臨床中我們發(fā)現(xiàn)，牙周炎治療后牙槽骨缺損難以自我修復(fù)；而在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，在一定代數(shù)以內(nèi)，牙周炎來源牙周膜干細(xì)胞仍然保持成骨分化能力降低的現(xiàn)象[5]。我們推測這現(xiàn)象跟微環(huán)境相關(guān)。為此，對于表觀遺傳的研究，能夠很好的解答微環(huán)

3、境與性狀保持的聯(lián)系[6]。2012年王存玉等研究出組蛋白去甲基化轉(zhuǎn)移酶KDM4B及KDM6B在人類間充質(zhì)干細(xì)胞中有利于成骨分化[7]。同時，有研究表明，慢性炎癥會導(dǎo)致表觀遺傳修飾發(fā)生改變[8]。2009年Ricardo Santiago Gomez對兩者作了一定的綜述[9]。鑒于目前存在研究未涉及具體的因子或機(jī)制，本課題運(yùn)用表觀遺傳修飾探討牙周炎發(fā)生時成骨分化能力下降的機(jī)制。
　　不僅如此，為了優(yōu)化干細(xì)胞的性狀，在體外培養(yǎng)中可以通

4、過添加適當(dāng)條件來改善微環(huán)境[51]。蛇床子素（Osthole）為天然小分子化合物，首次從蛇床子中發(fā)現(xiàn)[10]。有研究發(fā)表明，蛇床子素能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力、減緩關(guān)節(jié)炎疼痛等等[11]。大量研究同時證明，牙周炎的發(fā)展與炎癥發(fā)生及免疫紊亂具有相當(dāng)?shù)穆?lián)系[12]；結(jié)合牙周炎治療重點(diǎn)為牙槽骨缺損的修復(fù)，我們在本課題中運(yùn)用蛇床子素至牙周炎的研究當(dāng)中，探討其如何通過影響微環(huán)境作用于牙周炎來源PDLSCs的成骨分化能力。
　　目的:
　　通過

5、觀察體外應(yīng)用蛇床子素對牙周炎來源PDLSC增殖速率及成骨分化的影響，篩選合適的給藥濃度；探討合適濃度蛇床子素誘導(dǎo)一段時間后，牙周炎來源PDLSC成骨分化性狀的保持情況；研究合適濃度條件下，蛇床子素在牙周炎來源PDLSCs中對于乙?；D(zhuǎn)移酶及其下游靶點(diǎn)的改變。為研究牙周炎時牙槽骨缺損發(fā)生的機(jī)制提供全新的解釋，同時為小分子化合物在牙周組織修復(fù)中的作用途徑提供具體依據(jù)。
　　方法:
　　1、PDLSCs分離、純化、培養(yǎng)及鑒定

6、>　　采用酶消化法培養(yǎng)原代正常來源及牙周炎來源PDLSCs；通過有限稀釋法純化PDLSCs；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面特定標(biāo)記；克隆形成（Colony forming unit-firbroblast, CFU-F）實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞干性；噻唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium, MTT）檢測細(xì)胞增殖能力；成骨、成脂分化誘導(dǎo)檢測細(xì)胞多向分化能力。
　　2、蛇床子素對PDLSCs最適濃度的篩選
　　設(shè)立蛇床子素不

7、同濃度組（10-4Mol/L、10-5Mol/L、10-6Mol/L、10-7Mol/L、10-8Mol/L）；通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度蛇床子素對PDLSCs的細(xì)胞毒性；采用茜素紅染料染色檢測不同濃度蛇床子素對PDLSCs成骨能力的影響。結(jié)合上述兩種實(shí)驗(yàn)確定蛇床子素對PDLSCs的最適濃度。
　　3、蛇床子素對PDLSCs成骨分化的表觀遺傳修飾的影響
　　按照篩選出的蛇床子素最適合濃度，設(shè)計實(shí)驗(yàn)組：陽性對照組—H-PDLS

8、Cs+DMSO、空白對照組—P-PDLSCs+DMSO、實(shí)驗(yàn)組—P-PDLSCs+蛇床子素。于第3代細(xì)胞按照上述設(shè)計進(jìn)行蛇床子素誘導(dǎo)14d或21d；誘導(dǎo)后在相同的常規(guī)培養(yǎng)條件下進(jìn)行接種細(xì)胞、成骨分化誘導(dǎo)并行ALP染色及茜素紅染色；同時在相同的常規(guī)培養(yǎng)條件下進(jìn)行傳代；分別比較第4代、第6代及第10代內(nèi)3組細(xì)胞的ALP染色結(jié)果及茜素紅染色結(jié)果。根據(jù)前面的3個分組誘導(dǎo)PDLSCs，2d后提取總RNA及蛋白，進(jìn)行qRT-PCR及Western

9、blot檢測乙?；D(zhuǎn)移酶及其下游靶點(diǎn)的表達(dá)情況。4、干擾KAT6A或KAT6B后H-PDLSCs成骨分化能力的改變
　　對正常來源PDLSCs采用小干擾RNA進(jìn)行特定基因的干擾，然后提取總蛋白， Western blot檢測其表達(dá)水平及其下游靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)水平，確定小干擾RNA效果。同期，將采用小干擾RNA后的正常來源PDLSCs進(jìn)行常規(guī)成骨分化誘導(dǎo)21d，對其進(jìn)行茜素紅染色，探討特定基因干擾后，正常來源PDLSCs成骨分化能力的

10、變化。5、干擾KAT6A或KAT6B后在蛇床子素誘導(dǎo)下H-PDLSCs成骨分化能力的改變
　　將正常來源PDLSCs設(shè)立6組：對照組H-PDLSCs、H-PDLSCs+蛇床子素、H-PDLSCs-siRNA-KAT6A、H-PDLSCs-siRNA-KAT6B、H-PDLSCs-siRNA-KAT6A+蛇床子素、H-PDLSCs-siRNA-KAT6B+蛇床子素。干擾及加藥方法同前，成骨分化誘導(dǎo)21d，行茜素紅染色。
　　6

11、、統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間比較使用兩樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、所有樣本都能成功獲得原代PDLSCs；細(xì)胞在顯微鏡下呈長梭形；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明H-PDLSCs及P-PDLSCs中間充質(zhì)干細(xì)胞表面特定標(biāo)記（STRO-1、CD146、CD105、CD90）均為陽性

12、表達(dá)，而造血干細(xì)胞表面特定標(biāo)記（CD34、CD14）均為陰性表達(dá)；CFU-F實(shí)驗(yàn)說明H-PDLSCs及P-PDLSCs均具有細(xì)胞干性；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H-PDLSCs及P-PDLSCs具有自我增值能力；成骨分化誘導(dǎo)檢測可見到鈣化結(jié)節(jié)沉積，成脂分化誘導(dǎo)檢測可見脂滴形成，表明H-PDLSCs及P-PDLSCs具有多向分化能力。
　　2、在不同濃度蛇床子素對P-PDLSCs的誘導(dǎo)下，MTT檢測蛇床子素細(xì)胞毒性結(jié)果表明，10-4Mol/

13、L、10-5Mol/L蛇床子素對P-PDLSCs具有明顯的細(xì)胞毒性，10-6Mol/L、10-7Mol/L及10-8Mol/L蛇床子素對P-PDLSCs無細(xì)胞毒性；茜素紅染色結(jié)果顯示10-6Mol/L、10-7Mol/L及10-8Mol/L蛇床子素能夠增強(qiáng)P-PDLSCs的成骨分化能力，最適濃度為10-7Mol/L。
　　3、根據(jù)陽性對照組—H-PDLSCs+DMSO、空白對照組—P-PDLSCs+DMSO、實(shí)驗(yàn)組—P-PDLSC

14、s+蛇床子素設(shè)計分組，誘導(dǎo)14d后ALP染色結(jié)果表明第3代P-PDLSCs在蛇床子素14d的誘導(dǎo)下發(fā)生成骨分化功能學(xué)上的改變，并且這種改變能夠隨著傳代而進(jìn)行下去，在各組間相同的培養(yǎng)環(huán)境中依然能顯示出功能學(xué)的維持；qRT-PCR檢測乙?；D(zhuǎn)移酶基因表達(dá)結(jié)果顯示在乙酰基轉(zhuǎn)移酶家族中，只有KAT6A及KAT6B與蛇床子素的促進(jìn)成骨分化能力符合正相關(guān)關(guān)系；Weston-Blot檢測相關(guān)組蛋白乙?；磉_(dá)結(jié)果說明KAT6A、KAT6B、Histon

15、e3K9ac及Histone3K14ac的表達(dá)水平與蛇床子素的促進(jìn)成骨分化能力符合正相關(guān)關(guān)系。
　　4、采用小干擾RNA后， KAT6A及KAT6B均分別下調(diào)，其下游靶點(diǎn)H3K9ac及H3K14ac表達(dá)亦下降。茜素紅染色結(jié)果表示，干擾后，正常來源PDLSCs成骨分化能力下降。結(jié)果說明了，KAT6A及KAT6B在PDLSCs中對其成骨分化能力起著促進(jìn)作用。
　　5、采用小干擾RNA后，并加入蛇床子素，茜素紅染色結(jié)果表示，干擾K

16、AT6A及KAT6B并加入蛇床子素，正常來源PDLSCs成骨分化能力沒有恢復(fù)。結(jié)果說明了，蛇床子素促進(jìn)PDLSCs成骨分化能力的作用需要KAT6A及KAT6B在中間進(jìn)行連接。
　　結(jié)論:
　　1、不同濃度的蛇床子素對人P-PDLSCs的增殖速率及成骨分化產(chǎn)生不同程度的影響，濃度10-7Mol/L最有利于P-PDLSCs的存活及成骨分化。
　　2、P-PDLSCs在一定時間的蛇床子素誘導(dǎo)條件下，成骨分化能力的增強(qiáng)能夠隨著

17、細(xì)胞傳代而保持下去，細(xì)胞在成骨分化上發(fā)生表觀遺傳修飾的改變。
　　3、適當(dāng)濃度的蛇床子素在P-PDLSCs中通過調(diào)控KAT6A及KAT6B基因促進(jìn)成骨分化。
　　4、蛇床子素在 PDLSCs中通過促進(jìn) KAT6A及 KAT6B的表達(dá)及功能來影響Histone3K9及Histone3K14的乙酰化水平，從而上調(diào)細(xì)胞成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。
　　5、KAT6A及KAT6B在PDLSCs中對其成骨分化能力起著促進(jìn)作用；