miR-17~92家族介導(dǎo)的HDAC9對(duì)炎癥牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響.pdf

1、【研究背景】
　　牙周病是發(fā)病率最高的口腔疾病之一，會(huì)導(dǎo)致牙齦出血，牙槽骨吸收，牙周袋形成，牙齒松動(dòng)脫落。牙周潔治和牙周刮治等傳統(tǒng)牙周病治療方法只能延緩牙槽骨的吸收和疾病的進(jìn)展，無法從根本上改善牙槽骨吸收，并重建已吸收的牙槽骨。而牙周組織再生術(shù)通過植入骨或者骨的替代物和膜性材料誘導(dǎo)骨的生成。20世紀(jì)70年代末到80年代初，以Nyman為代表的一些學(xué)者經(jīng)過一系列研究發(fā)現(xiàn)在牙周組織再生術(shù)后的牙周組織修復(fù)愈合過程中，只有牙周膜組織具有組

2、織再生能力。2004年Byoung-Moo Seo等從牙周膜組織中分離出了具有多向分化潛能的干細(xì)胞—牙周膜干細(xì)胞（Periodontal Ligament Stem Cells，PDLSCs）。牙周膜干細(xì)胞成為最有潛力成為牙周組織重建的種子細(xì)胞。干細(xì)胞治療方法的興起為牙槽骨的重建帶來了新的希望。在炎癥狀況下細(xì)胞內(nèi)的基因序列并未發(fā)生變化，但是基因的表達(dá)卻與正常細(xì)胞有所不同，這種現(xiàn)象與細(xì)胞的表觀遺傳修飾的改變有著緊密聯(lián)系。
　　表觀遺

3、傳修飾是對(duì)染色體的共價(jià)修飾，不引起堿基序列的變化，但是可以導(dǎo)致穩(wěn)定的可遺傳的表型改變[1,2]。組蛋白乙酰化是表觀遺傳學(xué)的一種修飾方式，組蛋白去乙酰化酶（HDACs）移除組蛋白賴氨酸位點(diǎn)的乙?；鶊F(tuán)后使組蛋白與DNA結(jié)合變得緊密，阻礙了DNA啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，因此抑制了基因的轉(zhuǎn)錄。microRNA（miRNA）是一類長度在19~25nt的非編碼的內(nèi)源性小分子RNA，它能夠靶向與mRNA互補(bǔ)配對(duì)，通過抑制靶mRNA的翻譯或直接降

4、解靶mRNA，從而負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)和功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，HDAC抑制劑作用于人類乳房和肺腫瘤細(xì)胞激發(fā)了由miR-15和let-7介導(dǎo)的凋亡機(jī)制[3]。這說明了HDACs對(duì)miRNA也有調(diào)控作用。
　　劉亞麗等已經(jīng)證明在炎癥微環(huán)境下，PDLSCs中TNF-α、miR-17以及miR-17的靶基因 Smurf1可以形成一個(gè)協(xié)同的反饋調(diào)節(jié)，從而調(diào)控炎癥牙周膜干細(xì)胞(Inflammatory PDLSCs，i-PDLSCs)向成骨方向分

5、化[4]。本研究中我們從表觀遺傳的角度出發(fā)，研究HDAC酶對(duì)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力的影響并進(jìn)一步探討二者之間的影響是否由miR-17~92家族介導(dǎo)。
　　【研究目的】
　　本研究從表觀遺傳學(xué)的角度入手，首先研究HDAC酶對(duì)i-PDLSCs成骨分化的影響，以及進(jìn)一步探究HDAC酶對(duì)i-PDLSCs成骨分化的影響是否由miR-17~92家族介導(dǎo)。
　　【研究方法】
　　1. qRT-PCR和Western Blo

6、tting檢測i-PDLSCs與h-PDLSCs中HDAC酶的表達(dá)差異。
　　2.轉(zhuǎn)染HDAC9 siRNA后，qRT-PCR，Western Blotting和茜素紅染色鑒定i-PDLSCs成骨分化能力。
　　3.轉(zhuǎn)染miR-20a mimics和inhinitors后，qRT-PCR、Western Blotting和茜素紅染色鑒定i-PDLSCs的成骨分化能力。
　　4.轉(zhuǎn)染HDAC9 siRNA后，Taqman

7、 PCR檢測pri-miR-17~92的表達(dá)變化，qRT-PCR檢測miR-17~92家族成熟體的表達(dá)變化，Western Blotting觀察細(xì)胞內(nèi)H3K14和H4K16的乙?；健?br>　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　1.PCR檢測結(jié)果顯示，i-PDLSCs中HDAC9的表達(dá)較h-PDLSCs升高，其他HDAC酶變化差異沒有顯著性，Western Blotting檢測HDAC9表達(dá)的結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。
　　2.轉(zhuǎn)染

8、siRNA沉默HDAC9的表達(dá)后，qRT-PCR，Western Blotting和茜素紅染色的結(jié)果均顯示i-PDLSCs成骨分化能力上調(diào)。
　　3.i-PDLSCs中轉(zhuǎn)染miR-20a mimics后，細(xì)胞成骨分化能力升高；轉(zhuǎn)染miR-20a inhinitors后，細(xì)胞成骨分化能力降低。
　　4.轉(zhuǎn)染siRNA沉默HDAC9的表達(dá)后，i-PDLSCs中pri-miR-17~92表達(dá)升高，miR-17~92家族成熟體miR