低強度脈沖超聲波對牙周膜細胞成骨分化影響的初步研究.pdf

1、hPDLCs是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性多能干細胞,包含成纖維細胞、成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞及未分化間充質(zhì)細胞等多種細胞成分；它可分化為成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞并形成牙槽骨、牙骨質(zhì)及牙周膜,是牙周組織再生的細胞學基礎(chǔ),尤其對于牙周病治療具有極其重要的研究價值。牙周病治療終極目的是牙周組織再生和形成新附著。促進牙周組織再生的關(guān)鍵之一是牙槽骨新生,即誘導(dǎo)hPDLCs成骨分化并行使功能。在牙周病損區(qū)域中,hPDLCs數(shù)量和功能活性都是有限的。如

2、何促進該區(qū)域牙周膜細胞增殖及骨向分化對牙周病組織修復(fù)具有不可估量的研究價值。近年來,LIPUS因其具有縮短骨折愈合時間、增加骨密度、改善力學特性,促使軟骨骨化成熟等生物作用而被作為一種無創(chuàng)、安全、有效的治療方法廣泛用于骨折延遲愈合和骨不連等疾病治療。大量研究證實LIPUS作為一種機械信號,具備以下組織作用機制：促進組織中具有增殖分化潛能的前體細胞增殖及成骨分化；增強功能細胞生物活性；改善血液循環(huán)。因此,本研究首次將LIPUs引入誘導(dǎo)hP

3、DLCs成骨分化以促進牙周組織再生治療的研究具有重要意義。
　　 目的：⑴建立hPDLCs的LIPUS體外輻照模型,為下一步研究LIPUS對hPDLCs成骨分化影響提供實驗基礎(chǔ)。⑵通過連續(xù)動態(tài)觀察LIPUS對hPDLCs合成分泌堿性磷酸酶、骨鈣素的影響,探討LIPUS是否具有hPDLCs骨向誘導(dǎo)分化能力并遴選適宜參數(shù)。⑶以多個具有重要生理功能并可能在力學轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中處于調(diào)控樞紐地位的分子為切入點,研究LIPUS對hPDLCs in

4、tegrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1mRNA表達的影響,為揭示LIPUS對hPDLCs成骨分化調(diào)控機制提供一些實驗依據(jù)。
　　 方法：①采用組織塊法原代培養(yǎng)hPDLCs并傳代建立有限細胞系,進行形態(tài)學觀察、細胞組織學來源鑒定、繪制細胞生長曲線,為下一步LIPUS輻照提供實驗細胞。②采用第4代hPDLCs消化后接種于6孔板中,LIPUs輻照參數(shù)為:工作頻率1.5MHz；脈沖重復(fù)頻率1.0KHz；脈沖占空比1:4,幅

5、寬:200us；按輸出強度90mW/cm2、60mW/cm2、30mW/cm2；同一聲強輻照時間為10min,20min,30min分組,連續(xù)作用5天后檢測各組ALP活性并遴選適宜的輻照參數(shù)用于后續(xù)試驗。③采用第5代hPDLCs,按90mW/cm2-20min/d連續(xù)輻照15天,分別于5、7、9、11、13、15天時間點,采用生化法和放射免疫法檢測堿性磷酸酶和骨鈣素合成分泌情況。④取第5代hPDLCs,以90mW/cm2-20min/d

6、 LIPUS輻照處理5d,鏡下見細胞匯合約90％,收集需要檢測的細胞,采用RT-PCR檢測integrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1的mRNA表達情況。
　　 結(jié)果：⑴本實驗培養(yǎng)的hPDLCs細胞形態(tài)、生長曲線均與文獻報道相近,免疫組化證實所培養(yǎng)細胞來源于中胚層,結(jié)合取材部位說明本實驗培養(yǎng)細胞為牙周膜細胞,可用于本實驗研究。⑵經(jīng)LIPUS輻照后,各組ALP活性均有不同程度提高,其中90mW/cm2-20min/d組

7、改變最為明顯。⑶LIPUS連續(xù)輻照15天研究發(fā)現(xiàn),細胞裂解液中的ALP于第5天開始增加,第11天達峰值,第13天下降較明顯；分泌至上清液中的ALP于第9天開始增加,第11天達峰值,第13天時開始下降。同時,上清液中骨鈣素于第9天顯著增加,第15天達峰值。⑷以90mW/cm2-20min/d LIPUS輻照處理5d,引起integrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1mRNA表達不同程度上調(diào)。
　　 結(jié)論：①LIPUS對h

8、PDLCs骨向分化具有促進作用,本實驗條件下較適宜作用參數(shù)為90mW/cm2-20m in/d。②LIPUS(90mW/cm2-20min/d)連續(xù)作用15d,牙周膜細胞ALP合成于第5天開始增加,第9天開始ALP向胞外分泌增加,第11天時合成及分泌同時達峰值,于第13天時均有下降。骨鈣素作為成骨分化晚期標志蛋白,分泌于第9天顯著增加,第15天達峰值,LIPUS誘導(dǎo)合成高峰稍晚于堿性磷酸酶。③LIPUS輻照下integrinβ1、c-f

9、os、c-jun、cbfa1表達均有上調(diào),提示上述基因可能參與了LIPUS誘導(dǎo)hPDLCs骨向分化的調(diào)控過程。推測其可能機制為:LIPUS以機械應(yīng)力信號為主要形式作用于hPDLCs上,首先影響“細胞外基質(zhì)-整合素-細胞骨架”力學信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),通過MAPK信號通路將物理信號傳入核內(nèi),誘導(dǎo)即早基因c-fos、c-jun和成骨控制基因cbfa1轉(zhuǎn)錄翻譯增加,可能進一步形成AP-1或與cbfa1相互調(diào)節(jié)影響成骨相關(guān)基因的表達,如堿性磷酸酶、骨鈣