低強(qiáng)度脈沖式超聲波（LIPU）對(duì)體外兔BMSCs的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床常見(jiàn)疾患,由于其無(wú)神經(jīng)支配、缺乏血液供應(yīng)、軟骨細(xì)胞增殖遷移能力低等組織學(xué)特點(diǎn),關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力非常有限,損害后易出現(xiàn)不可逆的關(guān)節(jié)功能障礙,因此關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。目前實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)應(yīng)用軟骨下骨板鉆孔或微骨折等技術(shù),可使骨髓腔內(nèi)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)遷移到缺損區(qū),并增殖、分化形成類透明軟骨組織,盡管遠(yuǎn)期效果不理想,但也顯示了關(guān)節(jié)軟骨組織在特定的條件下具有一定的修復(fù)能力。因此

2、提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化能力并進(jìn)一步改善新生軟骨的質(zhì)量,可能是促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的有效途徑之一。而近年來(lái)的研究表明低強(qiáng)度脈沖超聲(LowIntensity Pulsed Ultrasound)能促進(jìn)骨折、骨不連的愈合,其機(jī)制是加速了軟骨的形成及軟骨內(nèi)骨化。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道,低強(qiáng)度脈沖超聲波具有促進(jìn)關(guān)節(jié)骨-軟骨缺損修復(fù)的作用。然而目前關(guān)于LIPU對(duì)BMSCs等生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制仍缺乏了解,臨床應(yīng)用缺乏足夠的理論和實(shí)驗(yàn)

3、依據(jù)。本課題擬通過(guò)構(gòu)建BMSCs-軟骨細(xì)胞的藻酸鹽三維共培養(yǎng)體系,予以不同強(qiáng)度LIPU刺激,觀察BMSCs的增殖能力、細(xì)胞表型及合成分泌細(xì)胞外特異性基質(zhì)、細(xì)胞調(diào)控因子水平的變化,從細(xì)胞、分子生物等層面探討LIPU對(duì)BMSCs的生物學(xué)效應(yīng)及可能的作用機(jī)制。 目的： 構(gòu)建BMSCs、軟骨細(xì)胞的藻酸鹽三維共培養(yǎng)體系,探討軟骨細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)微環(huán)境對(duì)BMSCs增殖、成軟骨分化的影響；對(duì)體外BMSCs-軟骨細(xì)胞三維共培養(yǎng)體系施加

4、LIPU刺激,觀察細(xì)胞生物學(xué)改變情況,探討LIPU對(duì)BMSCs的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制,為L(zhǎng)IPU在臨床中的進(jìn)一步合理應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.采用機(jī)械粉碎結(jié)合酶消化法獲取兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,通過(guò)體外平面培養(yǎng)擴(kuò)增、傳代,應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、II型膠原免疫組化染色鑒定細(xì)胞表型。 2.采用密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法從兔骨髓組織中分離、純化BMSCs,進(jìn)行體外平面培養(yǎng)擴(kuò)增,應(yīng)用免疫組化染色、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)志

5、物等方法對(duì)細(xì)胞表型、純度進(jìn)行鑒定。 3.采用藻酸鹽凝膠復(fù)合軟骨細(xì)胞、BMSCs構(gòu)建三維共培養(yǎng)體系,通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、繪制生長(zhǎng)曲線、H-E染色和II型膠原免疫組化染色等觀察藻酸鹽三維凝膠中細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化。 4.對(duì)BMSCs、軟骨細(xì)胞的藻酸鹽凝膠三維共培養(yǎng)體系予以強(qiáng)度為2mW/cm2、10mW/cm2、30mW/cm2的LIPU刺激,觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖及表型的變化；應(yīng)用II型膠原免疫組化染色法、甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞基

6、質(zhì)中Ⅰ型、Ⅱ型、X型膠原及蛋白多糖蛋白合成分泌情況：應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞aggrecan與I型、Ⅱ型、X型膠原mRNA的表達(dá)情況；應(yīng)用RT-PCR、Western-bloting法檢測(cè)細(xì)胞分化調(diào)控因子TGF-β1、IGF-I、bFGF的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.原代及第1-3代軟骨細(xì)胞貼壁后呈多角形,細(xì)胞形態(tài)、大小相近,融合區(qū)細(xì)胞呈典型的鋪路石狀,Ⅱ型膠原免疫組化染色陽(yáng)性,顯示其具有分泌軟骨細(xì)胞特征性基質(zhì)Ⅱ型膠原的能

7、力。 2.培養(yǎng)的BMSCs貼壁能力很強(qiáng),細(xì)胞形態(tài)為短梭形或紡錘形,細(xì)胞形態(tài)、大小相近；采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的第1-3代細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD29、CD44、CD105,不表達(dá)CD14、CD34、CD45;同時(shí),Ⅱ型、X型膠原免疫組化染色陰性,顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞為未分化的BMSCs。 3.藻酸鹽凝膠具有一定的彈性和強(qiáng)度及良好的組織相容性,軟骨細(xì)胞、BMSCs在藻酸鹽凝膠中具有良好的生物學(xué)活性；免疫組化鑒定發(fā)現(xiàn)與軟骨

8、細(xì)胞共培養(yǎng)的BMSCs的Ⅱ型膠原染色陽(yáng)性,而對(duì)照組為陰性,說(shuō)明體外軟骨細(xì)胞三維培養(yǎng)微環(huán)境可誘導(dǎo)BMSCs定向分化成軟骨細(xì)胞。 4.LIPU不影響B(tài)MSCs的活性；可促進(jìn)BMSCs增殖并合成軟骨組織特異性細(xì)胞外基質(zhì),其效應(yīng)與超聲波的強(qiáng)度相關(guān)。強(qiáng)度為2mW/cm2、10mW/cm2的LIPU促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,增加II型膠原、蛋白多糖合成分泌,上調(diào)TGF-β1、IGF-I mRNA表達(dá)。強(qiáng)度為30mW/cm2的LIPU促進(jìn)

9、BMSCs向肥大軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,增加Ⅱ型、X型膠原、蛋白多糖合成分泌增加,上調(diào)TGF-β1、IGF-I、bFGF mRNA表達(dá)。 結(jié)論： 1.通過(guò)機(jī)械粉碎酶消化法可獲取關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,經(jīng)單層傳代培養(yǎng)擴(kuò)增可在短時(shí)間內(nèi)獲得足量、純化的、具有良好生物學(xué)活性兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。 2.通過(guò)密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法可分離、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)過(guò)體外單層培養(yǎng)擴(kuò)增可獲得成分單一、未分化的BMSCs。該方法簡(jiǎn)便有效,分離、純化效果較

10、理想,收獲的第1至第3代BMSCs可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的種子細(xì)胞。 3.軟骨細(xì)胞-藻酸鹽凝膠與BMSCs-藻酸鹽凝膠在體外共培養(yǎng)可成功誘導(dǎo)BMSCs分化成軟骨細(xì)胞,提示除了傳統(tǒng)添加生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)方法以外,與同類細(xì)胞共培養(yǎng)的方法可能是更經(jīng)濟(jì)而有效的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法。 4.LIPU具有促進(jìn)BMSCs增殖的作用,強(qiáng)度為30mW/cm2 LIPU的效應(yīng)最為明顯。LIPU刺激可促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。2mW/cm2組、10m

11、W/cm2組可促進(jìn)BMSCs增殖,誘導(dǎo)其分化成軟骨細(xì)胞,以Ⅱ型膠原明顯增加為特征；30mW/cm2組可明顯促進(jìn)BMSCs增殖,誘導(dǎo)其分化成肥大軟骨細(xì)胞,以X型膠原明顯增加為特征,長(zhǎng)時(shí)間刺激可進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。 5.LIPU作用于細(xì)胞后產(chǎn)生獨(dú)特的空泡效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和溫?zé)嵝?yīng),通過(guò)影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的通透性或通過(guò)第二信使系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮作用,改變細(xì)胞調(diào)控因子TGF-β1、IGF-I、bFGF等基因表達(dá),再通過(guò)細(xì)胞自分泌、旁分