低強(qiáng)度脈沖超聲波促進(jìn)人髓核細(xì)胞合成胞外基質(zhì)功能性成分的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分低強(qiáng)度脈沖超聲波促進(jìn)人正常髓核細(xì)胞合成Ⅱ型膠原和蛋白聚糖最佳聲強(qiáng)度參數(shù)的篩選
　　 目的:有報(bào)道證實(shí)低強(qiáng)度脈沖超聲波(Low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)能促進(jìn)髓核細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)主要功能性成分：Ⅱ型膠原(COLL2)和蛋白聚糖(Proteoglycan，PG)。本研究在國(guó)內(nèi)首次使用人正常髓核細(xì)胞株(Human Nucleus

2、Pulposus Cell Line，HNPC)接受LIPUS作用，篩選出使細(xì)胞產(chǎn)生最大量COLL2和PG的強(qiáng)度參數(shù)(PG家族中研究最早最多的是Aggrecan，故以Aggrecan為代表檢測(cè))
　　 方法: LIPUS的頻率、作用時(shí)間等參數(shù)設(shè)定參考以往文獻(xiàn)結(jié)果(頻率1MHz，聲脈20μs，重復(fù)1.0KHz的LIPUS，每天作用20分鐘)，設(shè)立5個(gè)LIPUS聲強(qiáng)組：0、15、30、60、120mW/cm2，分別作用于HNPC，采

3、用Real-time PCR檢測(cè)COLL2和Aggrecan對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量，Western-Blotting檢測(cè)COLL2和Aggrecan蛋白的表達(dá)量，細(xì)胞免疫組化提供定性的形態(tài)學(xué)證據(jù)。
　　 結(jié)果: COLL2和Aggrecan蛋白表達(dá)量趨勢(shì)與其mRNA表達(dá)量趨勢(shì)接近：COLL2基因和蛋白表達(dá)相對(duì)量在30、60 mW/cm2兩個(gè)聲強(qiáng)組最多(此兩組之間比較P>0.05，與其他組比較P<0.05)，Aggrecan基因和蛋白表

4、達(dá)相對(duì)量在60、120cmW/cm2兩個(gè)聲強(qiáng)組最多(此兩組之間比較P>0.05，與其他組比較P<0.05)。但是，120cmW/cm2聲強(qiáng)組COLL2蛋白和基因表達(dá)相對(duì)量明顯下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論:選擇60mW/cm2聲強(qiáng)組作為促進(jìn)COLL2和Aggrecan最大表達(dá)量的LIPUS聲強(qiáng)參數(shù)。
　　 第二部分 LIPUS對(duì)IL-1β誘導(dǎo)HNPC退變模型合成基質(zhì)能力的影響
　　 目的: IL-1β可誘導(dǎo)H

5、NPC基質(zhì)合成能力下降，一定程度上模擬體內(nèi)退變環(huán)境，建立退變細(xì)胞模型；探討LIPUS對(duì)炎癥因子作用環(huán)境中的HNPC合成ECM的影響。
　　 方法:參考相關(guān)文獻(xiàn)內(nèi)容，使用IL-1β作用于正常HNPC48h后，建立退變的HNPC模型。采用聲強(qiáng)為60mW/cm2，頻率1MHz，聲脈20μs，重復(fù)1.0KHz的LIPUS。分組為：IL-1β+LIPUS(-)組、IL-1β+LIPUS(+)組、LIPUS(+)+IL-1β組。Real-t

6、ime PCR檢測(cè)COLL2、Aggrecan以及MMP-3、MMP-13對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量，Western-Blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)提供LIPUS作用后COLL2、Aggrecan蛋白表達(dá)變化的形態(tài)學(xué)證據(jù)。
　　 結(jié)果: LIPUS可以明顯提升在炎性因子IL-1β刺激環(huán)境下COLL2和Aggrecan對(duì)應(yīng)基因和蛋白的表達(dá)(P<0.05)。先接受LIPUS作用的正常HNPC，當(dāng)LIPUS停止后加入IL

7、-1β刺激，HNPC表達(dá)COLL2和Aggrecan對(duì)應(yīng)基因的能力下降到與IL-1β+LIPUS(-)組相當(dāng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Aggrecan蛋白較COLL2蛋白下降明顯；IL-1β上調(diào)MMP-3的作用強(qiáng)于上調(diào)MMP-13，MMP-3主要降解Aggrecan可能是Aggrecan下降更明顯的原因。細(xì)胞免疫熒光表現(xiàn)支持以上結(jié)果。
　　 結(jié)論: IL-1β可以有效的降低HNPC合成Aggrecan和COLL2的能力，構(gòu)建出合理的模擬體內(nèi)髓核

8、退變狀態(tài)的細(xì)胞模型；LIPUS促進(jìn)模擬退變狀態(tài)的HNPC合成Aggrecan、COLL2，具有潛在治療價(jià)值，但促進(jìn)作用在LIPUS停止后，下游效應(yīng)不能持久，炎性刺激環(huán)境降低細(xì)胞功能。
　　 第三部分 LIPUS促進(jìn)HNPC合成COLL2、Aggrecan的機(jī)制研究
　　 目的: LIPUS促進(jìn)軟骨和椎間盤(pán)細(xì)胞合成COLL2和Aggrecan，但具體機(jī)制不明。有報(bào)道證明LIPUS通過(guò)協(xié)同TGF-β1發(fā)揮對(duì)犬髓核細(xì)胞的正向調(diào)

9、節(jié)作用。我們使用HNPC來(lái)探索LIPUS的作用機(jī)制，更接近人的實(shí)際情況。
　　 方法:設(shè)計(jì)LIPUS組、LIPUS+TGF-β組和LIPUS+TGF-β+TGF-β1中和抗體組，Real-time PCR檢測(cè)COLL2、Aggrecan對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)進(jìn)一步提供LIPUS作用效果的直觀證據(jù)；Real-time PCR檢測(cè)LIPUS作用后TGFβR1mRNA的表達(dá)量；細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)連續(xù)時(shí)間LIPUS作用后I

10、ntegrina5β1與細(xì)胞骨架蛋白的聯(lián)動(dòng)效應(yīng)。
　　 結(jié)果: LIPUS+TGF-β1組COLL2、Aggrecan對(duì)應(yīng)基因表達(dá)相對(duì)量最大(P<0.05)，免疫熒光結(jié)果與其一致；當(dāng)加入足量的TGF-β1中和抗體后，效果發(fā)生了反轉(zhuǎn)，COLL2、Aggrecan對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量明顯降低于單純LIPUS作用組(P<0.05)。LIPUS刺激上調(diào)HNPC的TGFβR1基因表達(dá)；連續(xù)時(shí)間LIPUS作用后，HNPC表達(dá)Integrina5

11、β1量逐漸增多，細(xì)胞骨架逐漸解聚模糊，LIPUS停止作用后，Integrina5β1不表達(dá)，細(xì)胞骨架重新構(gòu)建。
　　 結(jié)論: LIPUS促進(jìn)HNPC合成COLL2、Aggrecan的機(jī)制為主要通過(guò)TGF信號(hào)通路。而且，LIPUS作用后，HNPC表達(dá)TGFβR1上調(diào)，提示LIPUS作用使得HNPC對(duì)TGF-β1的敏感性提高，以此模式發(fā)揮對(duì)TGF-β1的協(xié)同作用。LIPUS作為一種機(jī)械干預(yù)因素，其機(jī)械信號(hào)通過(guò)“ECM-integri

12、na5β1-F-actin”機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路轉(zhuǎn)換為HNPC內(nèi)第二信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞功能和狀態(tài)。
　　 第四部分 LIPUS對(duì)退變?nèi)怂韬私M織細(xì)胞合成COLL2、Aggrecan的影響
　　 目的:初步探討LIPUS對(duì)退變?nèi)怂韬私M織細(xì)胞合成COLL2、Aggrecan的影響。
　　 方法:手術(shù)獲得的人退變髓核組織細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。設(shè)計(jì)分組：LIPUS(+)組、LIPUS(-)組和DMEM/F12培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組

13、；ELISA檢測(cè)連續(xù)5次LIPUS作用，每次作用后上清液中的COLL2和Aggrecan含量；Western Blotting法檢測(cè)LIPUS作用前、LIPUS作用5天后、自然生長(zhǎng)5天后髓核細(xì)胞中COLL2和Aggrecan含量，評(píng)估LIPUS是否延緩了退變的進(jìn)展。
　　 結(jié)果: LIPUS作用下，連續(xù)測(cè)定培養(yǎng)基中COLL2和Aggrecan蛋白濃度變化趨勢(shì)曲線先升后降，作用兩次后，濃度達(dá)到最大，與作用前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

14、.05)；隨后，曲線下降，達(dá)到接近作用前濃度水平。同期自然生長(zhǎng)的退變髓核細(xì)胞培養(yǎng)基中COLL2和Aggrecan蛋白濃度呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，第5次作用后，蛋白濃度與LIPUS作用組相比較明顯下降(P<0.05)；Western Blotting結(jié)果顯示：LIPUS(+)組與LIPUS作用前組比較，COLL2和Aggrecan相對(duì)量接近(P>0.05)；與LIPUS(-)組相比，蛋白相對(duì)量明顯增多(P<0.05)。
　　 結(jié)論: L