低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)立體培養(yǎng)的人退變椎間盤髓核細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人退變椎間盤髓核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:通過人退變髓核細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，獲取足夠的髓核細(xì)胞供后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 方法:應(yīng)用0.25％的胰酶聯(lián)合0.2％Ⅱ型膠原酶消化法從腰椎間盤突出癥患者退變髓核組織中獲取髓核細(xì)胞，用COL2α1免疫細(xì)胞化學(xué)、CD24-PE細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定，并用β-半乳糖苷酶染色判定髓核細(xì)胞的衰老比例。
　　 結(jié)果:從退變腰椎間盤髓核組織中成功獲取原代退變髓核細(xì)胞并進(jìn)

2、行傳代培養(yǎng)。然后應(yīng)用COL2α1抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色和CD24-PE細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為髓核細(xì)胞。β-半乳糖苷酶染色法發(fā)現(xiàn)退變髓核細(xì)胞的衰老比例較高。
　　 結(jié)論:應(yīng)用酶聯(lián)合消化法能成功獲得原代退變髓核細(xì)胞，并能進(jìn)行傳代培養(yǎng)，從而提供足夠的細(xì)胞來源供進(jìn)一步研究。退變的髓核細(xì)胞中衰老細(xì)胞比例較高。
　　 第二部分低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)立體培養(yǎng)的人退變椎間盤髓核細(xì)胞的影響初步實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:

3、探討不同超聲強(qiáng)度的低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)三維立體培養(yǎng)的人退變髓核細(xì)胞的影響。
　　 方法:取第一部分實(shí)驗(yàn)中獲取的P2代退變髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)至藻酸鈣凝珠三維立體培養(yǎng)后予以不同超聲強(qiáng)度(0、15、30、60、120mW/cm2)的脈沖超聲刺激1周（20min/天）。分別用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，RT-PCR技術(shù)及western blot技術(shù)檢測細(xì)胞中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原在mRNA及蛋白水平的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果:超聲強(qiáng)度為30、60、

4、120mW/cm2組的細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組(0mW/cm2)組低，差異有顯著性(P＜0.05)，超聲強(qiáng)度為15mW/cm2組與對(duì)照組相比差異無顯著性(P＞0.05);在蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的mRNA及蛋白表達(dá)水平上，30、60、120mW/cm2組與對(duì)照組相比均有顯著性升高。
　　 結(jié)論:低強(qiáng)度脈沖超聲能抑制體外藻酸鈣凝珠立體培養(yǎng)的人退變髓核細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，從而延緩或修復(fù)椎間盤退變。
　　 第三部分

5、　　 低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)立體培養(yǎng)的人退變椎間盤髓核細(xì)胞的影響分子機(jī)制研究
　　 目的:探討低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)體外立體培養(yǎng)的人退變髓核細(xì)胞的影響及分子機(jī)制。
　　 方法:取第一部分實(shí)驗(yàn)中獲取的P2代退變髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)至藻酸鈣凝珠中三維立體培養(yǎng)。根據(jù)第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇超聲強(qiáng)度為30mW/cm2的LIPUS進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)分組如下:control組:除不予超聲刺激外同條件培養(yǎng)1周;LIPUS組:予以超聲刺激1周，20min/天;LI

6、PUS+LY294002組:予以超聲刺激并加入LY294002共培養(yǎng)1周。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。應(yīng)用ELISA法檢測上清中退變髓核細(xì)胞分泌的aggrecan、COL2α1、MMP-3和TIMP-1的濃度;應(yīng)用RT-PCR法和Western Blot法檢測細(xì)胞中aggrecan、COL2α1和Sox9在mRNA和蛋白水平的表達(dá)差異;應(yīng)用Western Blot法檢測細(xì)胞中activecaspase-3、Bcl-2、FAK、Akt、p

7、-FAK及p-Akt的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果:予以LIPUS刺激后，上清中的aggrecan、COL2α1和TIMP-1濃度較對(duì)照組升高(P＜0.05)，MMP-3濃度下降(P＜0.05)。予以LIPUS刺激后，細(xì)胞內(nèi)aggrecan、COL2α1和Sox9在mRNA及蛋白水平的表達(dá)與對(duì)照組比較均有明顯增高，F(xiàn)AK、Akt蛋白的表達(dá)無明顯變化，Bcl-2、p-FAK、p-Akt蛋白的表達(dá)增高，active caspase-3蛋白