兔髓核間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療退變椎間盤的實驗研究.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　研究髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞修復(fù)退變椎間盤能力的差異，為髓核間充質(zhì)干細(xì)胞治療退變椎間盤的進(jìn)一步應(yīng)用提供實驗根據(jù)。
　　實驗方法:
　　1.髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物活性檢測:髓核間充質(zhì)干細(xì)胞是通過流式細(xì)胞分選術(shù)獲得并培養(yǎng)，并進(jìn)行成骨、成軟骨、成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化實驗。成骨分化檢測包括堿性磷酸酶染色和和茜素紅染色。成軟骨分化與成脂肪檢測分別是通過甲苯胺藍(lán)染色鑒定與油紅O染液染色完成。
　　2.髓

2、核細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物活性檢測:髓核細(xì)胞是通過細(xì)胞貼壁法獲得并培養(yǎng)，進(jìn)行增殖能力的檢測、Ⅱ型膠原染色和甲苯胺藍(lán)染色。
　　3.實驗分組:將32只兔子進(jìn)行退變椎間盤模型建立，造模后隨機分為A、B、C、D組，分別為空白對照組，髓核間充質(zhì)干細(xì)胞移植組，髓核細(xì)胞移植組，單純培養(yǎng)液對照組。
　　4.影像學(xué)檢查:在細(xì)胞移植ld前及細(xì)胞移植12w后，行X線檢查以評估椎間盤高度指數(shù)(DHI％)，行MRI檢查以計算髓核區(qū)域相對信號強度(RSI

3、)。
　　5.PCR檢測:提取總RNA，把內(nèi)參引物序列GAPDH的表達(dá)量除膠原蛋白Ⅱ、蛋白聚糖的表達(dá)量，得到膠原蛋白Ⅱ、蛋白聚糖的相對表達(dá)量。
　　6.蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白定量檢測。
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析:選用spss20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P＞0.05表示無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗結(jié)果:
　　1.

4、髓核間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)分化及檢測中，堿性磷酸酶染色和和茜素紅染色均顯示陽性顯色。在成軟骨和成脂誘導(dǎo)分化及檢測中見甲苯胺藍(lán)染色見細(xì)胞呈藍(lán)色，并有大小不等的脂滴形成。
　　2.兔原代髓核細(xì)胞呈圓形，形態(tài)大小均一。細(xì)胞增殖活力在早期較低，而在5d-13d時明顯增強。甲苯胺藍(lán)染色與Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色見陽性。
　　3.在移植12w后，B組的高度指數(shù)(DHI％)與其他組相比明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05)。B組的RSI值

5、比C組明顯增強，顯著性差異(P＜0.05)。
　　4.在PCR檢測和蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白定量檢測可知，B組在蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白的基因表達(dá)水平高于其他組，有統(tǒng)計學(xué)意義。B組比C組蛋白聚糖的蛋白表達(dá)水平高，有顯著性差異，但四組在Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　實驗結(jié)論:
　　髓核間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞均能提高退變椎間盤內(nèi)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白基因水平的表達(dá)，促進(jìn)退變椎間盤的修復(fù)，但髓核間