骨髓基質干細胞移植修復椎間盤退變的實驗研究.pdf

1、目的: 椎間盤退變性疾病是腰背痛的主要原因，也是骨科最常見多發(fā)病。椎間盤發(fā)生退變后，間盤內最重要的變化是髓核內的膠原減少和蛋白多糖濃度的降低。目前針對此類疾病的治療方法有保守治療和外科手術治療等，但都有一定缺陷。而利用人自體椎間盤細胞、軟骨細胞或干細胞移植到椎間盤，移植后能產生新的細胞外基質，以此來逆轉椎間盤退變的過程是新的研究方向。隨著對干細胞的研究逐漸深入，我們認識到骨髓基質干細胞具有多向分化的潛能。本課題通過培養(yǎng)骨髓基質干

2、細胞，驗證了其來源充足，取材方便，擴增能力確切的各項優(yōu)點。為此，我們采用纖維環(huán)穿刺法制造大鼠尾椎間盤退變模型的方法，然后將干細胞注入退變椎間盤中，通過實驗對照，觀察骨髓基質干細胞移植到大鼠退變的椎間盤后阻逆或修復椎間盤退變的效果。 方法: 本實驗利用體外細胞培養(yǎng)技術，將大鼠骨髓基質干細胞白骨髓血中分離、純化和培養(yǎng)，先選用2周齡大鼠斷頸處死，取其脛骨、股骨，并去除兩干骺端，PBS沖洗髓腔，收集沖洗液，放入等體積的淋巴細胞分

3、離液，吸取中間乳白色層面細胞懸液，與5倍體積的PBS混合后，離心，獲取2×10<'6>/ml，放于20％DMEM培養(yǎng)液中，置入37℃、飽和濕度、5％CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后換液，72h后細胞鋪滿培養(yǎng)基(細胞生長融合達到80％～90％)，每3天換液，1傳4分瓶，此為傳一代，取第3～4代作為注射用。并制成單細胞懸液，進行干細胞的貼壁率檢測。從中選取3代生長狀態(tài)良好的細胞，進行骨髓基質干細胞的形態(tài)學觀察和生物學性能鑒定。 將W

4、istar大鼠隨機分成四組：正常組(A組)、模型組(B組)、模型組+干細胞/藻酸鹽組(C組)、模型組+藻酸鹽組(D組)。每組九只大鼠，每組分二周組、四周組、八周組三個亞組，平均每亞組三只大鼠。制造大鼠尾的椎間盤退變模型(B組)：顯微鏡下用21號針頭穿刺破壞纖維環(huán)并抽吸髓核組織。C組：在椎間盤穿刺抽吸髓核組織后立即注入干細胞/藻酸鹽復合物，細胞濃度為1×10<'6>/ml。D組：在椎間盤穿刺抽吸髓核組織后立即注入單純等量的藻酸鹽作為C組的

5、對照。 觀察骨髓基質干細胞在植入椎間盤后是否能夠延緩或修復椎間盤退變。分別于2、4、8周觀察大鼠尾椎間盤組織形態(tài)學變化，免疫組化法測定纖維環(huán)組織中Ⅰ型膠原的變化。 結果: 1、原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)顯示大鼠骨髓基質干細胞具有活躍的增殖倍增能力。 2、組織學檢測顯示A組椎間盤結構形態(tài)正常：椎間盤高度正常，纖維環(huán)排列整齊，髓核結構正常；B組椎間盤退變模型組顯示椎間盤結構破壞明顯：椎間盤高度下降，纖維環(huán)排列紊亂，髓

6、核基質含量減少；C組注入干細胞組顯示椎間盤整體結構較B組明顯恢復：椎間高度較B組好轉，纖維環(huán)排列較整齊，髓核基質成分增多；D組形態(tài)學改變與B組相似。 3、纖維環(huán)中工型膠原免疫組織化學分析：A組為正常，顯示纖維環(huán)排列整齊，纖維環(huán)中Ⅰ型膠原表達較多。B組纖維環(huán)結構破壞明顯，序列紊亂，Ⅰ型膠原表達減少。C組早期纖維環(huán)結構破壞明顯，序列紊亂，Ⅰ型膠原表達減少，2周后逐漸好轉：纖維環(huán)組織形態(tài)學排列逐漸整齊，Ⅰ型膠原表達逐漸增多，纖維環(huán)結構