骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療再生障礙性貧血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植治療再生性障礙性貧血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，為再生性障礙性貧血的治療尋找一種新的治療方法。 方法：⑴骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：取14天SD幼鼠雙側(cè)股骨，去除貼附在骨表面的肌肉組織，剪斷兩端骨垢，用α—MEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔細(xì)胞入離心管，吹打后離心8min（速度1000r/s），去上清，加入含10%胎牛血清的α—MEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105/mL接種，將細(xì)胞置于37℃恒溫、5%CO2的孵箱內(nèi)

2、培養(yǎng)，4h后換液去除未貼壁細(xì)胞，以后每3d換液。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70%—80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察骨髓基質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特征，應(yīng)用MTT法間接測(cè)定各代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞活性。檢測(cè)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44。⑵再生障礙性貧血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕ⅲ捍菩許D大鼠，體重200—250g，清潔級(jí)共50只，隨機(jī)分為對(duì)照組（10只）和模型組（40只）。模型組，腹腔注射5—氟尿嘧啶150mg/kg后第5天，白消安（馬利蘭片），2mg/片蒸

3、餾水懸液15mg/kg灌胃，每周1次連續(xù)3周。觀察指標(biāo)：①血常規(guī)檢查：分別對(duì)照組和模型組血液，生化儀檢測(cè)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積。②病理形態(tài)學(xué)觀察：取死亡動(dòng)物和定期處死動(dòng)物的股骨制作骨髓涂片，采用兩者聯(lián)合用藥的方案，成功建立了大鼠造血干細(xì)胞衰竭型再生障礙性貧血（再障）模型。⑶BrdU標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植入（尾靜脈）再障動(dòng)物模型：①BrdU標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞：待細(xì)胞約50%融合時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入BrdU（終濃度為10mo

4、l／L），繼續(xù)培養(yǎng)72h后取出細(xì)胞，多聚甲醛固定，過(guò)氧化氫處理，血清封閉，加一抗BrdU，37℃孵育2h，加生物素化二抗，加SABC，DAB顯色。②骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植：當(dāng)培養(yǎng)的第三代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞鋪滿瓶底50%時(shí)，加入BrdU（終濃度為10μmol/L）。繼續(xù)培養(yǎng)三天，吸去培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整到1×106／mL，通過(guò)老鼠尾靜脈移植（2mL／只）入再障動(dòng)物模型組；鹽水組和培養(yǎng)基組注入等量的鹽水和培養(yǎng)基。⑷移植效果：將制作的再障動(dòng)物模型隨機(jī)分為

5、鹽水組（10只）、培養(yǎng)基組（10只）、BMSCs治療組（10只）。待處死動(dòng)物后分析血常規(guī)變化，各組分別制作骨髓涂片并進(jìn)行常規(guī)染色和免疫組化染色，觀察骨髓結(jié)構(gòu)和免疫組化結(jié)果。 結(jié)果：①傳代培養(yǎng)4h，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞已開(kāi)始貼壁，培養(yǎng)7d時(shí)，見(jiàn)細(xì)胞鋪滿瓶壁面積的70%—80%，細(xì)胞排列緊密，此時(shí)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞鋪成單層；H—E染色見(jiàn)細(xì)胞多為長(zhǎng)梭型，有突起及分支，胞體大，單個(gè)核，大而圓，著色淺；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44免疫組織化學(xué)陽(yáng)

6、性。②再障動(dòng)物模型成功建立，骨髓涂片脂肪化明顯，骨髓增生程度降低。造血細(xì)胞減少，非造血細(xì)胞增多，各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)下降明顯符合再障的實(shí)驗(yàn)室診斷特點(diǎn)。③體外培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)，可見(jiàn)BrdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞。治療組大鼠骨髓涂片免疫組化可見(jiàn)BrdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞。④再障治療組的各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)明顯升高，且停藥后直至處死只有1只死亡；而鹽水組死亡3只，培養(yǎng)基組死亡4只。骨髓涂片免疫組化顯示，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于鹽水組、

7、培養(yǎng)基組；骨髓涂片顯示細(xì)胞數(shù)目增多，說(shuō)明骨髓間基質(zhì)干細(xì)胞移植治療再生障礙性貧血有效果。 結(jié)論：⑴骨髓基質(zhì)干細(xì)胞連續(xù)傳代的實(shí)驗(yàn)表明，第3—6代細(xì)胞純度高、活性好、增殖能力強(qiáng)，是進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的理想細(xì)胞模型。⑵本實(shí)驗(yàn)成功建立了SD大鼠再障模型，為干細(xì)胞治療再障的實(shí)驗(yàn)、藥物篩選和藥物作用機(jī)制的研究，提供了一個(gè)比較理想的動(dòng)物病理模型。⑶在骨髓涂片中看到了經(jīng)Brdu標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，說(shuō)明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有向骨髓歸巢的能力。⑷治療組骨髓