基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞移植對兔退變椎間盤細胞外基質(zhì)的影響.pdf

1、前言
　　退變性椎間盤疾病(DegenerativeDiscDisease，DDD)是由椎間盤退變(IntervertebralDiscDegeneration，IDD)引起的以頸肩腰腿疼痛為主要表現(xiàn)的臨床癥候群，包括腰間盤突出癥、腰椎管狹窄癥、頸椎病、椎間盤源性腰痛、頸腰椎不穩(wěn)癥等，是導(dǎo)致人群勞動能力喪失或下降的主要原因，對社會經(jīng)濟產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。IDD是DDD的前提和病理基礎(chǔ)，由于椎間盤組織再生能力有限，一旦發(fā)生退變，很難阻止

2、或逆轉(zhuǎn)。目前對DDD的治療主要包括應(yīng)用非甾體類抗炎藥物控制炎癥反應(yīng)的保守治療和脊柱融合或脊柱關(guān)節(jié)成型等手術(shù)治療，二者均只能有限的緩解椎間盤退變所引起的臨床癥狀，沒有對退變椎間盤的組織結(jié)構(gòu)進行修復(fù)，更不能從根本上延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變過程。盡管IDD確切的病因、病理生理過程仍然不十分明確，但最終共同的表現(xiàn)均為髓核細胞數(shù)量減少，生物活性下降以及細胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)含量的進行性減少，IDD的核心是椎間盤組

3、織合成代謝和分解代謝之間的不平衡所引起的。
　　既往的研究表明:髓核組織中的Ⅱ型膠原和蛋白多糖是構(gòu)成椎間盤ECM的主要成分，其含量的下降直接影響椎間盤的生物學(xué)功能。嘗試?yán)矛F(xiàn)代基因治療技術(shù)將能夠增強髓核細胞生物活性或能夠增加椎間盤ECM合成與抑制ECM降解的外源基因通過載體導(dǎo)入靶細胞，使目的基因在靶細胞內(nèi)表達并產(chǎn)生對機體有利的蛋白質(zhì)，增加椎間盤ECM的含量，可以達到減緩或逆轉(zhuǎn)IDD，改善椎間盤結(jié)構(gòu)，維持其正常生理功能的目的。目的基

4、因，載體和靶細胞選擇是基因治療中的三個關(guān)鍵因素;目前研究表明:干預(yù)椎間盤退變具有治療潛力的候選基因大致分為兩類:一類是促進ECM合成的基因:包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2，7）、胰島素樣生長因子(IGF-1)、Sox9等。另一類是促進ECM降解的基因，包括白介素(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MM

5、Ps)是椎間盤組織中重要的基質(zhì)降解酶之一，通過被激活后過度降解ECM參與椎間盤的退變。有研究顯示MMPs與內(nèi)源性金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissueinhibitorofmetalloproteinases，TIMPs)之間的平衡失調(diào)是導(dǎo)致IDD的重要原因。通過嘗試抑制分解代謝的途徑增加ECM含量在IDD的基因治療中是一種新的思路，TIMPs逐漸成為治療IDD熱門的候選基因。目的基因成功導(dǎo)入靶細胞需要應(yīng)用載體的輔助，因此選擇安全高效的轉(zhuǎn)基

6、因載體是基因治療中的關(guān)鍵因素。病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高的特點，特別是腺病毒載體能夠有效的轉(zhuǎn)染非分裂期靜止的細胞，對于轉(zhuǎn)染椎間盤細胞具有一定的優(yōu)勢，被認(rèn)為是比較理想的載體。理想的靶細胞當(dāng)然是椎間盤同源細胞，但椎間盤組織內(nèi)的低細胞密度可能妨礙足夠數(shù)量細胞被轉(zhuǎn)染，限制目的基因表達產(chǎn)物的產(chǎn)量，降低生物學(xué)效應(yīng);退變椎間盤組織獲取髓核細胞非常困難，而且髓核細胞分離、培養(yǎng)難度很大。近年來，許多試驗探索骨髓間充干細胞(BoneMesenchymalSte

7、mCell，BMSC)作為靶細胞治療IDD，取得了令人鼓舞的效果。BMSCs具有高度的可塑性和多向分化能力，容易獲取且相對容易掌控，在活體內(nèi)具有很高擴張能力;更為重要的是BMSCs可以感受組織損傷后微環(huán)境的變化，在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中可以分化出類髓核細胞。因此，BMSCs不僅可以作為單獨的細胞移植發(fā)揮其對退變椎間盤的修復(fù)作用，而且可以作為基因治療中的靶細胞，為目的基因表達蛋白產(chǎn)物提供場所，是IDD基因治療中理想的靶細胞。
　　IDD是一

8、個多因素參與的復(fù)雜過程，遺傳學(xué)機制尚不明確。目前開展基因治療的基礎(chǔ)性研究還十分有限，最終從實驗室走向臨床還面臨諸多困難。本課題針對目前該領(lǐng)域內(nèi)的一些前沿問題，進行科學(xué)合理的實驗設(shè)計，通過體外將攜帶金屬蛋白酶組織抑制劑-1(hTIMP-1)cDNA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，通過轉(zhuǎn)基因BMSCs移植的方式注入兔退變椎間盤髓核中，對目的基因表達情況以及目的基因表達產(chǎn)物對椎間盤組織ECM的作用效果進行分析，用以評價其對兔退變椎間盤ECM的影響

9、，探索IDD最佳的基因治療方式，為提高基因治療IDD的療效提供理論依據(jù)。
　　實驗方法
　　實驗一:基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建:以含hTIMP-1cDNA序列的質(zhì)粒為模板，通過PCR方法擴增hTIMP-1cDNA片段，將hTIMP-1cDNA全長定向克隆到AdMaxTM腺病毒系統(tǒng)穿梭質(zhì)粒pDC316上，構(gòu)建pDC316-hTIMP-1穿梭質(zhì)粒，并通過PCR與酶切方法鑒定構(gòu)建正確;利用AdMaxTM腺病

10、毒包裝系統(tǒng)和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，穿梭質(zhì)粒pDC316-hTIMP-1及骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1，3Cre共同轉(zhuǎn)染HEK293細胞，同源重組構(gòu)建含hTIMP-1cDNA的重組腺病毒載體Ad-hTIMP-1，通過PCR方法鑒定重組腺病毒載體Ad-hTIMP-1的正確性;使用陰離子柱層析方法純化重組腺病毒載體Ad-hTIMP-1并使用TCID50法測定Ad-hTIMP-1感染性滴度。
　　實驗二:重組腺病毒載體Ad-hTIMP-1

11、轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞的實驗研究:采用梯度離心法體外分離并培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD45，CD34，CD44及CD90的表達，鑒定BMSCs的正確性;使用攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒載體質(zhì)粒pYr-adshuttle-4體外轉(zhuǎn)染BMSCs，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，確定最佳感染復(fù)數(shù)值(MultiplicityOfInfection，MOI);按照最佳MOI值轉(zhuǎn)染BMSCs，設(shè)立重

12、組腺病毒載體Ad-hTIMP-1轉(zhuǎn)染BMSCs為hTIMP-1組，腺病毒載體質(zhì)粒pYr-adshuttle-4轉(zhuǎn)染BMSCs為陰性對照組，BMSCs為空白對照組;熒光定量PCR，Western-blot及免疫細胞化學(xué)等方法檢測hTIMP-1在BMSCs中的表達。
　　實驗三:Ad-hTIMP-1轉(zhuǎn)染BMSCs移植對兔退變椎間盤細胞外基質(zhì)的影響:采用纖維環(huán)穿刺法手術(shù)建立兔L3/4，L4/5，L5/6椎間盤退變模型;在模型制作過程中，

13、隨機分為單純BMSCs移植組，轉(zhuǎn)基因BMSCs移植組和對照組，使用微量注射的方法分別向椎間盤髓核組織中注射單純BMSCs懸液，Ad-hTIMP-1轉(zhuǎn)基因BMSCs懸液和PBS液;術(shù)后12周通過影像學(xué)檢查，手術(shù)取材后通過大體標(biāo)本與病理學(xué)檢查評估椎間盤退變程度;使用紫外分光光度法和免疫組化方法測定椎間盤髓核組織ECM，即Ⅱ型膠原與蛋白多糖的含量，評價轉(zhuǎn)基因BMSCs移植對退變椎間盤髓核組織ECM含量的影響;通過熒光定量PCR，western

14、-blot及免疫組化方法檢測椎間盤髓核組織hTIMP-1在mRNA和蛋白水平的表達。采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以X±S形式表達，采用單因素方差分析，獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗一:基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建:以pMD-hTIMP-1質(zhì)粒為模板的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在630bp左右可見到DNA條帶，與預(yù)計長度一致，說明成功擴增出目的hTIMP-1

15、cDNA片段;重組穿梭質(zhì)粒pDC316-hTIMP-1為模板進行PCR，獲得PCR擴增產(chǎn)物;重組穿梭質(zhì)粒pDC316-hTIMP-1經(jīng)EcoRⅠ和SaⅡ雙酶切;將擴增產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在3.9kb和630bp左右可見到DNA條帶;與預(yù)計長度一致，說明成功將目的基因hTIMP-1克隆到穿梭質(zhì)粒pDC316載體質(zhì)粒上;運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，完成同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒Ad-hTIMP-1;

16、以Ad-hTIMP-1病毒液為模板進行PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在630bp左右出現(xiàn)DNA條帶，與預(yù)計長度一致，說明成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-hTIMP-1;半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測定重組腺病毒Ad-hTIMP-1的感染性滴度為1×1010IU/ml。
　　實驗二:Ad-hTIMP-1重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞的實驗研究:梯度離心法成功分離兔BMSCs，流式細胞儀檢測CD44及CD90陽性細胞比例為9

17、5.61％及96.53％，CD34及CD45陽性細胞比例為0.76％及12.77％，符合BMSCs細胞表型;以攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒載體質(zhì)粒pYr-adshuttle-4(滴度為1×1010pfu/ml)轉(zhuǎn)染BMSCs后24h鏡下觀察綠色熒光:MOI為1000時鏡下90％細胞內(nèi)可見綠色熒光，細胞形態(tài)良好，轉(zhuǎn)染效率達90％;熒光定量PCR及Western-Blot結(jié)果顯示:與陰性對照組和空白對照組相比，hTIMP-1組中hTIMP-1在

18、mRNA水平（hTIMP-1組239.3746±19.5800，空白對照組1.0037±0.1044，陰性對照組1.0038±0.1079）以及蛋白水平（hTIMP-1組0.41，空白對照組0.02，陰性對照組0.09）均有明顯表達，差異具有顯著性(P＜0.05);免疫組化結(jié)果顯示，hTIMP-1組BMSCs胞漿中充滿棕黃色顆粒，而陰性對照組與空白對照組BMSCs胞漿中未見棕黃色顆粒，證實hTIMP-1蛋白在BMSCs胞漿中的有效表達。

19、
　　實驗三:Ad-hTIMP-1轉(zhuǎn)染BMSCs移植對兔退變椎間盤細胞外基質(zhì)的影響:通過大體觀察及病理學(xué)檢查證實纖維環(huán)穿刺法成功建立兔椎間盤退變模型;相對于對照組，轉(zhuǎn)基因BMSCs移植組與單純BMSCs移植組椎間盤退變程度減輕;放射線檢查提示:與轉(zhuǎn)基因BMSCs移植組(0.896±0.039)及BMSCs移植組（0.842±0.0428）相比，對照組（0.791±0.036）椎間隙相對高度減少更加明顯，差異具有顯著性（P＜0.05

20、）;分光光度法及免疫組化證實:與轉(zhuǎn)基因BMSCs移植組（0.896±0.039，0.354±0.022）以及BMSCs移植組（0.842±0.0428，0.272±0.014）相比，對照組(0.791±0.036，0.218±0.013)髓核組織內(nèi)細胞外基質(zhì)即蛋白多糖與Ⅱ型膠原含量減少更加明顯，差異具有顯著性(P＜0.05);BMSCs移植組與轉(zhuǎn)基因BMSCs移植組相比，蛋白多糖與Ⅱ型膠原含量明顯減少，差異具有顯著性（P＜0.05）;熒

21、光定量PCR，Western-blot以及免疫組化結(jié)果證實:轉(zhuǎn)基因BMSCs移植組髓核中hTIMP-1在mRNA和蛋白水平均有明顯表達（P＜0.05）。
　　結(jié)論
　　成功構(gòu)建含有基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(hTIMP-1)cDNA的重組腺病毒載體(Ad-hTIMP-1)，病毒感染性滴度為1×1010IU/ml。攜帶有hTIMP-1cDNA的重組腺病毒載體（Ad-hTIMP-1）可以高效轉(zhuǎn)染兔BMSCs并能夠穩(wěn)定表達hTI

22、MP-1外源基因。腺病毒介導(dǎo)hTIMP-1轉(zhuǎn)基因BMSCs移植以及單純BMSCs移植兔退變椎間盤，均可以有效減輕椎間盤退變程度，增加細胞外基質(zhì)含量;腺病毒介導(dǎo)hTIMP-1轉(zhuǎn)基因BMSCs移植兔退變椎間盤，通過外源hTIMP1基因的有效表達，抑制細胞外基質(zhì)降解以及BMSCs移植促進細胞外基質(zhì)合成的雙重作用，能夠更加有效的增加細胞外基質(zhì):即蛋白多糖與Ⅱ型膠原的含量，效果優(yōu)于單純BMSCs移植。因此，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)與細胞移植技術(shù)相結(jié)合的方式干