腺病毒介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑2基因轉(zhuǎn)染抑制主動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)降解的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該課題主要目的:基質(zhì)降解是目前主動(dòng)脈疾病研究的一個(gè)新熱點(diǎn).該實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建攜帶抑制血管壁細(xì)胞外基質(zhì)降解的基因——基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)的復(fù)制型缺陷型重組腺病毒載體AdTIMP-2,在體外研究證實(shí)其能夠有效轉(zhuǎn)染主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(SMC),成功表達(dá)TIMP-2蛋白質(zhì),并對(duì)血管SMC具有抑制增殖、侵襲作用的基礎(chǔ)上,構(gòu)建大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型,將腺病毒溶液直接灌注到主動(dòng)脈局部,觀察到腹主動(dòng)脈瘤形成過程中細(xì)胞外基質(zhì)降解的作用.該課

2、題主要方法:1.攜載TIMP-2基因的腺病毒載體(pAdEasy-1/TIMP-2)的構(gòu)建;從含有TIMP-2目的基因的質(zhì)粒pGEM/TIMP-2中純化回收目的基因,繼而再將其定向插入到復(fù)制缺陷型腺病毒載體pAdEasy-1,通過酶切鑒定挑選重組正確的克隆.應(yīng)用電穿孔法轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組腺病毒轉(zhuǎn)進(jìn)HEK293包裝細(xì)胞,進(jìn)一步大量制備重組腺病毒,并純化和測定滴度.同時(shí)對(duì)其使用的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià).2.AdTIMP-2體外轉(zhuǎn)染

3、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞及其對(duì)靶細(xì)胞的作用;分離培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈SMC,以不同MOI值的AdTIMP-2轉(zhuǎn)染SMC,應(yīng)用免疫熒光染色標(biāo)記被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,測定轉(zhuǎn)染效率.以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和Western雜交分別檢測AdTIMP-2轉(zhuǎn)染SMC后TIMP-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄及TIMP-2蛋白的表達(dá),以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TIMP-2蛋白的分泌.用MTT法測定AdTIMP-2轉(zhuǎn)染大鼠主動(dòng)脈SMC后TIMP-2

4、對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響.采用體外侵襲小室(Boyden Chamber)的方法研究TIMP-2對(duì)SMC侵襲能力的影響.應(yīng)用凝膠酶譜學(xué)分析(Zymography)的方法檢測了AdTIMP-2轉(zhuǎn)染后SMC分泌MMPs的改變.還檢測了目的基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡程度的改變.3.AdTIMP-2轉(zhuǎn)染抑制主動(dòng)脈基質(zhì)降解的作用;用豬胰腺彈力蛋白酶灌注法建立大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型.于主動(dòng)脈局部灌注高濃度AdTIMP-2重組腺病毒溶液,注藥后14天測定主動(dòng)脈直徑改

5、變;組織病理學(xué)觀察主動(dòng)脈炎癥反應(yīng)和基質(zhì)降解程度;抗TIMP-2、MMP-2抗體免疫組織化學(xué)染色檢測TIMP-2及MMP-2蛋白在主動(dòng)脈組織中的表達(dá);應(yīng)用組織原位雜交技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后主動(dòng)脈組織中的TIMP-2 mRNA及MMP-2 mRNA的表達(dá)情況.該課題主要結(jié)論如下:1.利用細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法能夠高效的構(gòu)建攜載目的基因的重組腺病毒載體,重復(fù)性好,流程相對(duì)簡單,所得到的重組腺病毒滴度高、純度好、毒性低.2.我們構(gòu)建的攜帶TIMP-2基因