間充質(zhì)干細(xì)胞注射對(duì)大鼠退變椎間盤的作用.pdf

1、目的： 分離、擴(kuò)增并鑒定大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，建立并驗(yàn)證大鼠尾椎間盤退變模型，探討間充質(zhì)干細(xì)胞注射對(duì)鼠尾椎間盤退變的作用。 方法： 用穿刺抽吸法收集大鼠股骨和脛骨內(nèi)的骨髓，密度梯度離心法和貼壁法分離并純化間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外擴(kuò)增，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制第一代、第三代和第五代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。用流式細(xì)胞鑒定檢測(cè)第三代細(xì)胞表面標(biāo)記CD90、CD34和CD45表達(dá)情況。對(duì)第4代細(xì)胞進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化，并用茜素紅染色鑒定成骨

2、誘導(dǎo)分化結(jié)果，以及用油紅O染色鑒定成脂誘導(dǎo)分化結(jié)果。選取健康3月齡SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組(8只)、退變組(8只)、培養(yǎng)基注射組(8只)和實(shí)驗(yàn)組(16只)，并對(duì)后三組的Co7/Co8、Co8/Co9和Co9/Co10椎間盤用細(xì)針穿刺纖維環(huán)法誘導(dǎo)退變。造模2周后拍攝X光片觀察造模效果，并向?qū)嶒?yàn)組造模椎間盤內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)基注射組造模椎間盤內(nèi)注射等體積干細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)照組、退變組不予特殊處理。分別于造模后1周、2周、3周、4周

3、抽取4只試驗(yàn)組大鼠和其他三組大鼠各2只麻醉后拍攝尾椎正位片，測(cè)量椎間盤高度，并計(jì)算椎間盤高度指數(shù)。放射學(xué)檢查后對(duì)抽取的大鼠實(shí)施過(guò)量麻醉處死，取出Co7/Co8椎間盤和相鄰的上下部分椎體，固定、切片，行HE染色和番紅-固綠染色評(píng)估椎間盤組織學(xué)改變。完整取出Co8/Co9和Co9/Co10椎間盤，分別用1，9-二甲胺基甲基藍(lán)結(jié)合法和二甲氨基苯甲醛比色法檢測(cè)Co8/Co9椎間盤內(nèi)GAG和羥脯氨酸含量；提取出Co9/Co10椎間盤內(nèi)總RNA后，

4、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其中聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： 分離和純化的間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增迅速，流式細(xì)胞鑒定顯示細(xì)胞表達(dá)CD90，不表達(dá)CD34和CD45。茜素紅染色和油紅O染色證明擴(kuò)增后的細(xì)胞仍具有成骨和成脂分化能力。放射學(xué)，生物化學(xué)和定量PCR檢查發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，退變組和培養(yǎng)基注射組的椎間盤高度、椎間盤內(nèi)GAG含量、聚集蛋白聚糖mRNA表達(dá)水平均有不同程度降低(p<0.05)，并表現(xiàn)出隨時(shí)間下降的趨勢(shì)。而實(shí)

5、驗(yàn)組與退變組相比，上述指標(biāo)均表現(xiàn)出一定的改善趨勢(shì)，注射4周后GAG含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。組織學(xué)觀察到造模后隨時(shí)間進(jìn)展的椎間盤退變過(guò)程，實(shí)驗(yàn)組與退變組相比，退變程度相對(duì)較輕。椎間盤內(nèi)羥脯氨酸含量，各組間沒有明顯差異(p>0.05)。 結(jié)論： 間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化相對(duì)容易、體外擴(kuò)增迅速，擴(kuò)增后仍保持其多向分化潛能。細(xì)針穿刺法誘導(dǎo)大鼠尾椎間盤退變模型成模時(shí)間短，效果可靠，經(jīng)濟(jì)便利。向大鼠鼠尾椎間盤退變模型內(nèi)注射間充