持續(xù)壓力對兔椎間盤髓核細胞線粒體及細胞外基質(zhì)合成代謝的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 原代椎間盤髓核細胞的體外分離及培養(yǎng)
　?、逶顾骷毎捏w外分離及培養(yǎng)
　　目的:建立體外兔椎間盤脊索細胞的藻酸鹽凝膠培養(yǎng)模型,并觀察其形態(tài)及生物學特點。
　　方法:膠原酶消化法及不連續(xù)密度梯度離心法體外分離收集原代椎間盤脊索細胞,于1.2％低粘度藻酸鹽凝膠中進行培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、Ⅱ型膠原免疫熒光染色進行細胞表型初步鑒定,并分別以死活細胞染色及活細

2、胞計數(shù)試劑盒(CCK-8法)檢測細定胞在藻酸鹽凝膠中的存活情況及細胞增殖能力。
　　結(jié)果:成功分離獲得原代椎間盤脊索細胞,其可穩(wěn)表達Ⅱ型膠原。原代細胞在藻酸鹽凝膠中生長良好,但增殖緩慢。
　　結(jié)論:初步了解兔椎間盤脊索細胞體外生物學特性,為椎間盤退變機制及組織工程學髓核種子細胞的研究提供了一定的實驗依據(jù)。
　?、嬖浌菢蛹毎捏w外分離培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系的建立
　　目的:觀察非接觸共培養(yǎng)條件下脊索細胞對軟骨樣細胞增

3、殖及生物學特性的影響。方法:無菌條件下取4周齡日本大白兔胸腰段脊柱,獲取髓核組織,酶消化法及不連續(xù)密度梯度法分離純化的脊索細胞及軟骨樣細胞。取第2代軟骨樣細胞與脊索細胞按1:1的比例接種于共培養(yǎng)裝置 Transwell小室中,單層培養(yǎng)的軟骨樣細胞設(shè)為對照組。培養(yǎng)1,3,7和10d后倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況,免疫熒光法鑒定細胞表型,CCK-8法測定細胞增殖,RT-PCR檢測Ⅱ型膠原、蛋白多糖的表達。
　　結(jié)果:成功地分離純化

4、獲取脊索細胞及軟骨樣細胞。鏡下觀察見原代脊索細胞體積較大,呈圓形或橢圓形,直徑10～15μm,胞漿內(nèi)含較多大小不等的囊泡;原代貼壁的軟骨樣細胞體積較脊索細胞小,呈短梭形,直徑4～6μm。隨著非接觸共培養(yǎng)時間的延長,軟骨樣細胞增殖明顯加快,以共培養(yǎng)7,10d明顯(P<0.05);Ⅱ型膠原、蛋白多糖的表達量也逐漸增高。
　　結(jié)論:脊索細胞能促進髓核軟骨樣細胞的增殖,其可能在阻止椎間盤退變的發(fā)生中具有一定意義。
　　第二部分 持續(xù)

5、壓力對體外單層培養(yǎng)兔椎間盤髓核細胞線粒體及細胞外基質(zhì)合成代謝的影響
　　目的:本研究的目的在于觀察線粒體途徑是否參與了壓力誘導(dǎo)的兔髓核細胞凋亡這一病理過程中。
　　方法:可控加壓裝置用于觀察持續(xù)壓力(壓力強度為1.0Mpa)對單層培養(yǎng)髓核細胞行壓力負荷6,12,18,24及36h后造成的生物學效應(yīng)。細胞活力情況通過細胞計數(shù)試劑盒 CCK-8檢測,細胞凋亡率通過流式細胞儀進行分析,倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學改變,凋亡相關(guān)的

6、基因和蛋白表達分別通過實時熒光定量(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)PCR和Western-blot來進行分析。Western-blot檢測細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的蛋白表達。細胞線粒體功能主要通過線粒體膜通透孔、活性氧及線粒體膜電位進行分析。
　　結(jié)果:該壓力強度在上述時間點內(nèi)能使細胞活力明顯降低、細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的蛋白表達減少,且能誘導(dǎo)兔椎間盤髓核細胞發(fā)生凋

7、亡改變。而且該壓力能顯著抑制髓核細胞線粒體功能,表現(xiàn)為細胞線粒體膜通透孔的開放、活性氧的過度產(chǎn)生及線粒體膜電位的降低。
　　結(jié)論:該壓力不僅能抑制髓核細胞細胞外基質(zhì)蛋白合成代謝,而且還誘導(dǎo)髓核細胞凋亡。且其誘導(dǎo)的髓核細胞凋亡可能部分通過線粒體凋亡途徑所介導(dǎo)。線粒體途徑介導(dǎo)的髓核細胞凋亡可能是椎間盤發(fā)生退行性改變的重要機制。
　　第三部分 持續(xù)壓力對體外藻酸鹽凝膠立體培養(yǎng)兔椎間盤髓核細胞線粒體及細胞外基質(zhì)合成代謝的影響

8、　　目的:本研究通過建立兔椎間盤髓核細胞藻酸鹽凝膠立體培養(yǎng)模型,觀察壓力干預(yù)對髓核細胞線粒體功能及相關(guān)基因表達的影響。
　　方法:將髓核細胞置于1.2％的低粘度藻酸鹽凝膠中進行立體培養(yǎng),再行壓力干預(yù)12,24,36,40及48 h后觀察相應(yīng)的生物學效應(yīng)。如酶標儀檢測細胞線粒體脫氫酶活性,相關(guān)的基因表達通過實時熒光定量 RT-PCR來進行分析。
　　結(jié)果:該壓力強度在上述時間點內(nèi)能降低兔椎間盤髓核細胞細胞外基質(zhì)蛋白多糖mRNA