低強(qiáng)度脈沖超聲促進(jìn)骨髓來源細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)和骨髓有核細(xì)胞均來源于骨髓，對醫(yī)學(xué)的發(fā)展起著非常重要的作用，現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨髓來源細(xì)胞的一種，具有取材方便，體外易培養(yǎng)，增殖快等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是組織工程學(xué)中修復(fù)和替換病損組織和器官、以及功能重建理想的種子細(xì)胞。但是目前種子細(xì)胞數(shù)量不足，體外常規(guī)擴(kuò)增無法滿足臨床研究及組織工程學(xué)產(chǎn)業(yè)化需求，這極大地制約其發(fā)展。骨髓

2、有核細(xì)胞作為骨髓中的主要成份，對人體造血、免疫等有重要作用，當(dāng)骨髓有核細(xì)胞減少或者增生低下時(shí)，會(huì)引起嚴(yán)重的血液、免疫系統(tǒng)疾病。
　　由此可見骨髓來源細(xì)胞不足或者增生低下時(shí)，對人體多個(gè)組織器官系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。目前很多學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些促進(jìn)骨髓來源細(xì)胞增殖的方法和藥物，但都存在不完善之處。因此，尋求一種更安全、更有效的技術(shù)手段以獲得足夠數(shù)量、具有再生活力的骨髓來源細(xì)胞已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中急需解決的關(guān)鍵問題。
　　近年來

3、，低強(qiáng)度脈沖超聲(Low-Intensity Pulsed Ultrasound，LIPUS)作為一種安全的純“綠色”物理技術(shù)手段，具有操作安全簡便、費(fèi)用低廉等特點(diǎn)。目前，已應(yīng)用于臨床骨與軟組織創(chuàng)傷的愈合，使用安全，已經(jīng)取得顯著效果。前期實(shí)驗(yàn)初步探究了LIPUS促進(jìn)BMSCs增殖的可行性。由此，本課題在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上繼續(xù)深入研究，并著眼于骨髓，將LIPUS分別作用于離體BMSCs和活體兔骨髓有核細(xì)胞，進(jìn)一步探索能否找到擴(kuò)增骨髓來源細(xì)胞

4、的新途徑。
　　目的：
　　1.觀察不同參數(shù)的低強(qiáng)度脈沖超聲對體外分離培養(yǎng)的BMSCs增殖的影響，篩選能提高BMSCs增殖效率的適宜的低強(qiáng)度脈沖超聲參數(shù)。
　　2.進(jìn)一步驗(yàn)證適宜參數(shù)LIPUS對體外分離培養(yǎng)BMSCs增殖效應(yīng)的影響，探討LIPUS促進(jìn)BMSCs增殖的有效性和安全性。
　　3.觀察LIPUS對活體兔骨髓來源有核細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響，初步探討LIPUS在促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞增殖方面的作用。
　　方法：

5、
　　1.為篩選后續(xù)研究適宜的LIPUS參數(shù)，實(shí)驗(yàn)選用頻率為0.6 MHz，強(qiáng)度為0.03、0.1、0.2、0.3 W/cm2的LIPUS分別輻照體外培養(yǎng)的第三代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5、10、15、20、30 min，各參數(shù)組輻照一次，24 h后倒差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法和流式細(xì)胞儀檢測LIPUS輻照后細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞周期。
　　2.將體外分離培養(yǎng)的第三代BMSCs隨機(jī)分為2組：LIPUS輻照組和

6、對照組。采用前期實(shí)驗(yàn)篩選出的適宜參數(shù)0.2 W/cm2，10min進(jìn)行輻照，連續(xù)輻照8 d。輻照后每天鏡下觀察細(xì)胞生長情況、四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期及增殖指數(shù)(PI)。
　　3.將120只新西蘭大白兔隨機(jī)分為LIPUS組、自身對照組和正常組。LIPUS連續(xù)輻照5 d后，分別于輻照前，輻照5 d后(1)每天觀察兔的生長情況；(2)第6 d、8 d、10 d、12 d進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、觀察骨髓增

7、生程度變化；(3)輻照處進(jìn)行皮膚、肌肉組織病理切片。
　　結(jié)果：
　　1.各參數(shù)組經(jīng)過LIPUS輻照后24 h觀察細(xì)胞分裂增殖均較空白對照組明顯活躍，細(xì)胞集落更為密集。細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞增殖指數(shù)均明顯高于空白對照組(P<0.05)，其中以0.2 W/cm2，10 min輻照后促進(jìn)增殖效果最為顯著。
　　2.LIPUS能夠明顯促進(jìn)BMSCs增殖，LIPUS組于輻照后各天細(xì)胞分裂增殖活性較對照組明顯活躍，細(xì)胞集落更為密集；

8、MTT法檢測LIPUS組于輻照前、輻照后1 d、3 d、5 d、7 d的細(xì)胞增殖活性均明顯高于對照組(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖指數(shù)提示LIPUS組于輻照后各天均明顯高于對照組(P<0.05)。
　　3.輻照5 d后每天觀察兔的生活習(xí)慣與正常組比較，未發(fā)現(xiàn)明顯異常。LIPUS組輻照5 d后，6 d、8 d的骨髓增生程度、骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯高于自身對照組和正常組(P<0.05)。自身對照組骨髓有核細(xì)胞數(shù)與正常組比較，沒有

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。輻照處的皮膚和肌肉組織病理切片：LIPUS輻照后皮膚表皮及真皮層均未見異常，肌肉紋理清晰，染色較淺，其內(nèi)均未見炎性細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.LIPUS對體外分離培養(yǎng)的BMSCs增殖具有明顯的促進(jìn)作用。
　　2.LIPUS輻照一定時(shí)間后能夠促進(jìn)BMSCs增殖，其中強(qiáng)度為0.2W/cm2，輻照10 min劑量促進(jìn)增殖效率最佳。
　　3.LIPUS對活體兔骨髓來源有核細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用