濃縮生長因子對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖及成骨分化能力的影響.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在將體外原代培養(yǎng)的人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligamentstem cells，hPDLSCs)接種于濃縮生長因子（concentrated growth factors，CGF）纖維蛋白膜上，以臨床較普遍應(yīng)用的海奧生物膜作為對(duì)照，觀察hPDLSCs在兩種膜表面增殖以及成骨分化的情況，從而為骨組織工程構(gòu)建一種新型移植物提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.hPDLS

2、Cs體外分離培養(yǎng)與鑒定
　　通過酶消化法對(duì)hPDLSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)純化細(xì)胞;利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面間充質(zhì)干細(xì)胞抗原標(biāo)志物的表達(dá);在體外成骨、成脂肪、成軟骨條件下對(duì)hPDLSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，檢測(cè)其多向分化潛能;進(jìn)行hPDLSCs的傳代，收集第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.CGF制備與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析:
　　利用特殊Vacuette真空采血管抽取患者靜脈血9ml，置入配套Medifuge離心機(jī)差速離

3、心。棄除上部血清層與底部紅細(xì)胞層，將中間CGF纖維蛋白層凝膠壓制成膜，HE法檢測(cè)其組織結(jié)構(gòu)，ELISA法分析內(nèi)部生長因子釋放特點(diǎn)。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞接種
　　(1)實(shí)驗(yàn)分組:CGF膜組、海奧膜組及空白組。
　　(2)接種培養(yǎng):取生長狀態(tài)良好的第3代hPDLSCs，消化離心后成特定密度的單細(xì)胞懸液，分別接種于CGF膜表面、海奧膜疏松層表面、空白24孔板中。
　　4.貼壁檢測(cè):接種5天后，于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍

4、照。
　　5.細(xì)胞接種培養(yǎng)1、3、5、7天后，應(yīng)用CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線，檢測(cè)三組不同條件對(duì)hPDLSCs增殖活性的影響。
　　6.成骨誘導(dǎo)7天后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR及Western-Blot法對(duì)hPDLSCs進(jìn)行成骨相關(guān)mRNA及成骨相關(guān)蛋白表達(dá)量的檢測(cè)，研究其成骨能力的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功應(yīng)用酶消化法在體外分離培養(yǎng)hPDLSCs，所篩選細(xì)胞在形態(tài)上符合成纖維樣細(xì)胞特點(diǎn);誘導(dǎo)條件下可向

5、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞方向分化，符合干細(xì)胞的特征;流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示人間充質(zhì)干細(xì)胞表面陽性標(biāo)記物(CD73，CD90，CD105，CD44)在hPDLSCs表面呈現(xiàn)高表達(dá)，陰性標(biāo)記物(CD11b，CD19，CD34，CD45，HLA-DR)在hPDLSCs表面無表達(dá)。
　　2.靜脈血經(jīng)差速離心后分三層，中間凝膠狀物質(zhì)即為CGF，壓制成膜后，HE染色見其主要由纖維蛋白網(wǎng)格構(gòu)成，內(nèi)嵌合大量白細(xì)胞與血小板，底部有薄層紅細(xì)胞;E

6、LISA檢測(cè)結(jié)果顯示其主要生長因子TGFβ-1、PDGF-BB與IGF-1雖釋放規(guī)律不同，但均可長效釋放。
　　3.貼壁檢測(cè)結(jié)果顯示:光學(xué)顯微鏡下可見hPDLSCs由CGF膜表面順延爬出，細(xì)胞長軸與CGF表面基本垂直，以膜為中心呈現(xiàn)放射性生長，膜周邊細(xì)胞呈梭形，排列緊密，垂直附著于CGF膜表面，使其呈固定狀態(tài)，不隨培養(yǎng)基漂移;海奧膜膜外細(xì)胞生長相對(duì)無序，細(xì)胞呈梭形，排列稀疏，板底細(xì)胞與海奧膜間未發(fā)生附著關(guān)系。
　　4.CCK

7、-8結(jié)果顯示:同海奧膜組與空白組相比，膜培養(yǎng)1、3、5及7天后CGF膜組細(xì)胞數(shù)量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但第1-3天，海奧膜組與空白組細(xì)胞增殖活性無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第3-5天海奧膜組細(xì)胞數(shù)量高于空白組(P＜0.05)，第5-7天時(shí)空白組細(xì)胞數(shù)量高于海奧膜組(P＜0.05)。
　　5.RT-PCR結(jié)果顯示:三組細(xì)胞均在成骨條件下誘導(dǎo)7天后，CGF膜組的成骨相關(guān)基因ALP、Col-Ⅰ、OPN、Runx-2的mRNA表達(dá)均高于其它

8、兩組(P＜0.05)，海奧膜組次之，空白組即基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)液組最低，各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.Western-Blot結(jié)果顯示:三組細(xì)胞均在成骨條件下誘導(dǎo)7天后，CGF膜組的成骨相關(guān)蛋白ALP、Col-Ⅰ、OPN、Runx-2的蛋白表達(dá)均高于其它兩組，海奧膜組次之，空白組即基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)液組最低，與RT-PCR結(jié)果吻合。
　　結(jié)論:
　　1.hPDLSCs具有較強(qiáng)的增殖能力，表達(dá)間充質(zhì)干