生長(zhǎng)分化因子-5誘導(dǎo)人黃韌帶細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制.pdf

1、黃韌帶骨化（Ossification of ligamentum flavum，OLF）是一種發(fā)生在脊柱韌帶的特殊類型異位骨化形式。OLF主要累及亞洲黃種人，尤其是日本人。男女發(fā)病率文獻(xiàn)報(bào)道不一，約為2-4：1，隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)病率增高，年齡大于65歲的亞洲人群發(fā)病率高達(dá)20%。OLF可發(fā)生在頸，胸和腰椎，但好發(fā)生于下胸椎和胸腰段，導(dǎo)致椎管狹窄，常引起脊髓壓迫受損，表現(xiàn)出一系列的神經(jīng)功能障礙。目前，OLF的臨床治療局限于椎管減壓手術(shù)，但是

2、其診斷延誤、OLF的多發(fā)性和術(shù)后骨化復(fù)發(fā)是造成患者脊髓功能恢復(fù)差的重要原因。近年來(lái)，OLF逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界的關(guān)注與重視。國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)有關(guān)OLF病因?qū)W研究的報(bào)道逐漸增加，雖然目前認(rèn)為遺傳因素、生長(zhǎng)因子、力學(xué)因素、內(nèi)分泌與代謝異常等因素與OLF發(fā)病密切相關(guān)。但其具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚。 組織學(xué)研究證實(shí)骨化黃韌帶組織表現(xiàn)為韌帶肥厚，彈力纖維減少，膠原纖維大量增生、腫脹，在骨化與非骨化韌帶組織間的交界區(qū)（骨化移行區(qū)）可見大量的軟骨樣細(xì)

3、胞。因此，這提示OLF屬于異位軟骨內(nèi)成骨病變。免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)某些成骨誘導(dǎo)因子（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（BMPRs）在骨化移行區(qū)的未成熟的軟骨樣細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)BMP-2誘導(dǎo)OLF形成的作用。提示這些成骨誘導(dǎo)因子可通過(guò)旁分泌或自分泌的形式與黃韌帶細(xì)胞胞膜上的受體結(jié)合并刺激細(xì)胞成骨分化，在黃韌帶的軟骨內(nèi)骨化過(guò)程發(fā)揮重要作用。前期研究表明體外分離培養(yǎng)的下胸椎黃

4、韌帶骨化患者非骨化區(qū)域的黃韌帶細(xì)胞呈現(xiàn)典型的成骨細(xì)胞表型特征。近年來(lái)，體外研究表明牽張應(yīng)力和瘦素等致病因素可誘導(dǎo)人黃韌帶細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。因此，各種致病因素誘導(dǎo)黃韌帶細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化可能是OLF發(fā)病的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員由多種同功酶組成，其中ERK1/2，p38和JNK發(fā)現(xiàn)較早，生物學(xué)功能研究較為透徹。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的通道之一，可被多種刺激因素激活，通過(guò)三

5、級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終磷酸化靶蛋白，激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等多種生理過(guò)程。許多研究證實(shí)MAPK信號(hào)通路參與成骨細(xì)胞增殖分化過(guò)程。最近，體外研究表明牽張應(yīng)力和瘦素通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)黃韌帶細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。因此，MAPK信號(hào)通路在OLF的發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。 生長(zhǎng)分化因子-5 （GDF-5）又稱為BMP-14或軟骨衍生形態(tài)發(fā)生蛋白-1（CDMP-1），是TGF-β超家族中的新成

6、員。其編碼基因定位于20q11.2染色體，由兩個(gè)外顯子（exon）和一內(nèi)含子（intron）組成，全長(zhǎng)488 kb，其編碼多肽共含有501個(gè)氨基酸，由位于N端的信號(hào)肽、中間的前體肽以及C端的成熟肽構(gòu)成。翻譯后的前體蛋白裂解得到成熟肽，由其發(fā)揮生物活性作用。成熟的GDF-5二聚體分子量為25KD，而單體分子為13.6KD。不同種屬來(lái)源的GDF-5分子具有高度同源性。它與骨軟骨發(fā)育，肌腱/韌帶損傷修復(fù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等密切相關(guān)。 GDF-

7、5像其它TGF-β超家族的成員（如BMPs）一樣，以同源二聚體的形式與跨膜Ser-Thr激酶受體結(jié)合，通過(guò)胞漿內(nèi)Smad信號(hào)途徑和非Smad信號(hào)途徑（如MAPK）將其信號(hào)傳導(dǎo)到核內(nèi)，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。最近，MAPK信號(hào)通路在GDF-5生物效應(yīng)中的作用引起一些學(xué)者的重視。體外研究證實(shí)GDF-5可誘導(dǎo)人臍靜脈平滑肌細(xì)胞的ERK磷酸化和小鼠軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5的p38和ERK磷酸化。 體內(nèi)研究表明人重組GDF-5 （rhGDF-5）

8、可促進(jìn)骨缺損修復(fù)和脊柱后外側(cè)融合；將含rhGDF-5的基質(zhì)植入大鼠皮下或肌肉內(nèi)，可誘導(dǎo)異位骨形成。體外研究報(bào)道GDF-5能誘導(dǎo)多能間充質(zhì)細(xì)胞C2C12、脂肪干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨膜細(xì)胞等多種細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。因此，GDF-5可誘導(dǎo)多種細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和異位骨形成。 組織病理學(xué)研究表明GDF-5在OLF的黃韌帶組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，而在無(wú)骨化的對(duì)照樣本中無(wú)表達(dá)。這一研究結(jié)果提示GDF-5可能是OLF的主要致病因子之一，但其具體機(jī)

9、制不清楚。因此，研究GDF-5在OLF發(fā)病過(guò)程中分子機(jī)制，以其作為切入點(diǎn)進(jìn)一步闡明OLF的發(fā)病機(jī)制，將為臨床OLF的預(yù)防、早期干預(yù)與治療提供新思路。 目的： 1.探討人黃韌帶細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)方法，建立黃韌帶細(xì)胞系。 2.探討rhGDF-5誘導(dǎo)人黃韌帶細(xì)胞成骨分化的作用。 3.探討rhGDF-5對(duì)人黃韌帶細(xì)胞的MAPK信號(hào)通路激活的作用，并觀察信號(hào)阻斷劑對(duì)rhGDF-5誘導(dǎo)黃韌帶細(xì)胞成骨分化的影響。

10、 方法： 1.人黃韌帶細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。 采集胸腰椎骨折患者后路減壓術(shù)中和腰椎間盤突出癥患者后路開窗髓核摘除術(shù)中的黃韌帶標(biāo)本。黃韌帶標(biāo)本用PBS液清洗后，剪成大小約0.5 mm的碎塊，并用0.2%Ⅰ型膠原酶消化液消化90 min。將膠原酶預(yù)消化組織塊均勻貼附在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板或10 ml培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中靜置8h后，沿孔板側(cè)壁小心加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

11、培養(yǎng)5-7d后首次更換培養(yǎng)液，隨后每隔3天更換。原代細(xì)胞從組織塊遷出、生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的細(xì)胞消化液消化并傳代培養(yǎng)。 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞從組織塊遷出時(shí)間，原代和傳代細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法分析傳1、3、5代細(xì)胞（P1、3、5）的增殖特性，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間，并比較細(xì)胞傳5代以內(nèi)的生物學(xué)特性的變化。對(duì)傳3代細(xì)胞進(jìn)行波形蛋白和Ⅰ型膠原

12、的免疫熒光化學(xué)染色。 2.rhGDF-5誘導(dǎo)人黃韌帶細(xì)胞成骨分化的作用。 （1）黃韌帶細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)。 人黃韌帶細(xì)胞與100ng/ml thGDF-5分別共孵育0，4，7，10，14 d或分別與0，10，50，100，500ng/ml thGDF-5共孵育10 d后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)ALP活性。 （2）黃韌帶細(xì)胞骨鈣素mRNA表達(dá)的檢測(cè)。 人黃韌帶細(xì)胞與100ng/

13、ml rhGDF-5分別共孵育0，4，7，10，14 d或分別與0，10，50，100，500ng/ml rhGDF-5共孵育10 d后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)黃韌帶細(xì)胞的骨鈣素mRNA表達(dá)，以β-acin為內(nèi)對(duì)照，分析骨鈣素mRNA相對(duì)表達(dá)的變化。 （3）黃韌帶細(xì)胞骨鈣素蛋白表達(dá)的檢測(cè)。 人黃韌帶細(xì)胞與100ng/ml rhGDF-5分別共孵育0，4，7，10，14d或分別

14、與0，10，50，100，500ng/ml rhGDF-5共孵育10d后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)黃韌帶細(xì)胞的骨鈣素蛋白表達(dá)，以β-acin為內(nèi)對(duì)照，分析骨鈣素蛋白相對(duì)表達(dá)的變化。 （4）黃韌帶細(xì)胞骨鈣素定位表達(dá)的檢測(cè)。 人黃韌帶細(xì)胞接種于置有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入含10.0%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合后，加入100ng/ml rhGDF-5繼續(xù)培

15、養(yǎng)10d。免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)骨鈣素的定位表達(dá)，細(xì)胞爬片依次用1：100稀釋的山羊抗骨鈣素多克隆抗體和1：50稀釋的FITC熒光標(biāo)記的兔抗山羊IgG孵育，共聚焦顯微鏡下觀察。 （5）茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色。 人黃韌帶細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入含10.0%FBS的DMEM培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)融合后，加入100ng/ml rhGDF-5或者對(duì)照培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)28d。茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成。 3.rhGDF-5誘導(dǎo)人黃韌

16、帶細(xì)胞成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 （1）MAPKs磷酸化活性的檢測(cè)。 人黃韌帶細(xì)胞與100 ng/ml rhGDF-5分別共孵育0、5、15、30、60、120、240min后收集細(xì)胞；在阻斷實(shí)驗(yàn)中，黃韌帶細(xì)胞與20μM的信號(hào)阻斷劑U0126、SB203580或SP600125預(yù)孵育60min，將含阻斷劑的培養(yǎng)基吸出，無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。再加入含100ng/ml rhGDF-5的培養(yǎng)基，60分鐘后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白

17、。Western blot檢測(cè)MAPK（ERK1/2、p38、JNK）總蛋白及磷酸化蛋白含量，以總蛋白為對(duì)照，分析磷酸化蛋白含量相對(duì)值的變化。 （2）MAPKs信號(hào)阻斷劑對(duì)rhGDF-5誘導(dǎo)人黃韌帶細(xì)胞成骨分化的影響。 人黃韌帶細(xì)胞與20μM U0126、SB203580或SP600125和100 ng/ml rhGDF-5共孵育10d后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)ALP活性，Western blot檢測(cè)骨鈣素蛋白表達(dá)