體外誘導(dǎo)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞成骨分化的實驗研究.pdf

1、目的:觀察在體外培養(yǎng)條件下，使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液和不同濃度鈣離子誘導(dǎo)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞發(fā)生成骨分化的效果，以此初步探討腎臟Randall斑形成的可能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。
　　方法:體外培養(yǎng)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，實驗分為5個組:成骨誘導(dǎo)液組（+成骨誘導(dǎo)液）、CaⅠ組（+0.5mmol/LCa2+）、CaⅡ組（+1.5mmol/LCa2+）、CaⅢ組（+2.5mmol/LCa2+）和對照組(+PBS)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)至第1d、3d、6d、9d

2、時，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。誘導(dǎo)至第9d時，用細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑盒和改良鈣鈷法磷酸酶染色試劑盒對各組細(xì)胞進(jìn)行染色，于倒置顯微鏡下拍照，觀察鈣結(jié)節(jié)形成和堿性磷酸酶的表達(dá)情況。同樣，收集培養(yǎng)至第9d時的各組樣本，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。另外，于細(xì)胞培養(yǎng)的第0、3、6和9d，采用RT-qPCR和Western bloting檢測上述各組細(xì)胞Runx2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:MTT試驗結(jié)果:CaⅡ組和C

3、aⅢ組可明顯抑制細(xì)胞的增殖活性;CaⅠ組和成骨誘導(dǎo)液組則無明顯抑制細(xì)胞增殖活性的作用;細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果:細(xì)胞培養(yǎng)至第9d時，3個濃度鈣離子誘導(dǎo)液組和成骨誘導(dǎo)組的細(xì)胞凋亡率分別是4.5％、37％、55％和2％，正常對照組為0.5％;細(xì)胞茜素紅鈣染色結(jié)果:成骨誘導(dǎo)組和高鈣離子組均可見典型陽性紅色鈣結(jié)節(jié)表現(xiàn)，而對照組呈現(xiàn)陰性;堿性磷酸酶染色結(jié)果:高鈣離子組均可以見到典型的黑色塊狀的硫化鈷沉淀物，而正常對照組染色結(jié)果陰性;RT-qPCR結(jié)果:

4、成骨誘導(dǎo)組、CaⅡ組分別培養(yǎng)至第3d、6d、9d時，細(xì)胞樣本Runx2 mRNA表達(dá)水平均高于0d組，和0d組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);第9d時，CaⅠ組、CaⅡ組、CaⅢ組其細(xì)胞Runx2 mRNA表達(dá)均高于對照組，和對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5、Western blotting結(jié)果:與0d組比較，培養(yǎng)至第3d、6d、9d時的成骨誘導(dǎo)組和CaⅡ組細(xì)胞Runx2蛋白的表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)