神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向成骨分化的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）并向成骨方向進(jìn)行誘導(dǎo)，通過加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF），研究NGF在成骨培養(yǎng)基中對(duì)山羊BMSCs增殖及分化的影響。為闡明NGF促進(jìn)牽張成骨術(shù)（DO）中骨形成的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，希望所建立的實(shí)驗(yàn)方法能為將來進(jìn)一步的臨床和科研工作建立穩(wěn)定的細(xì)胞模型，從而使?fàn)繌埑晒切g(shù)中促進(jìn)牽張區(qū)新骨生成，解決臨床問題提供一種可能。
　　 方法：抽取山羊骨髓，利用Percoll分離液進(jìn)行密度梯度離心結(jié)合貼壁

2、法分離山羊BMSCs，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，觀察其形態(tài)學(xué)變化。體外培養(yǎng)至第三代后，首先用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物，以鑒定細(xì)胞純度，排除了雜質(zhì)細(xì)胞的干擾；再將第三代BMSCs分為A、B、C、D四組，A組(空白對(duì)照組)：用含10％胎牛血清的低糖DMEM常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。B組(成骨誘導(dǎo)對(duì)照組):成骨誘導(dǎo)液為常規(guī)培養(yǎng)液中加入10-8mol/L地塞米松、50mg/L維生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。C組(NGF組)：常規(guī)培養(yǎng)液中加入終濃度為10

3、0ng/ml的NGF。D組(實(shí)驗(yàn)組)：成骨誘導(dǎo)液中加入終濃度為100ng/ml的NGF。于第3,5,7天利用MTT法測(cè)定各培養(yǎng)組細(xì)胞增殖活性，第14天檢測(cè)各組細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素（OC）水平、第21天應(yīng)用Von Kossa染色的方法檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)的形成，比較各組細(xì)胞成骨性能，觀察NGF對(duì)山羊BMSCs增殖及向成骨分化的影響。
　　 結(jié)果：⑴利用Percoll分離液進(jìn)行密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離、純化山羊BMSCs，是

4、一種簡(jiǎn)便可行的方法，可獲得較高的純度，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得CD90、CD105為強(qiáng)陽性表達(dá)，CD34、CD45為陰性。⑵MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，A組和C組細(xì)胞增殖率相似，B組和D組細(xì)胞增殖率相似，但B、D兩組明顯低于A、C兩組，差異有顯著性意義（p<0.05）。⑶各組細(xì)胞成骨性能檢測(cè)結(jié)果：A組和C組ALP和OC表達(dá)均無明顯差異（p>0.05），B組和D組ALP和OC表達(dá)明顯高于A組和C組，且D組較B組表達(dá)水平增高，差異有顯著性意義（p<0

5、.05）。A、C兩組細(xì)胞Von Kossa染色陰性，未見明顯的鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)；B組細(xì)胞Von Kossa染色陽性，可見黑色鈣化結(jié)節(jié)，D組較成骨誘導(dǎo)對(duì)照組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目明顯增多，面積增大。
　　 結(jié)論：密度梯度離心結(jié)合貼壁法是分離、純化山羊BMSCs的簡(jiǎn)便實(shí)用的方法，傳至第三代即可獲得較高的純度。單純使用NGF對(duì)山羊BMSCs并無明顯促進(jìn)增殖及分化的作用，但NGF在山羊BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中具有明顯的促進(jìn)作用。這為加快骨形成，