納米相羥基磷灰石對骨髓間充質(zhì)干細胞生長及成骨分化的影響.pdf

1、因創(chuàng)傷感染腫瘤等原因引起的骨缺損目前仍無較好的治療方法。傳統(tǒng)方法主要以自體骨片移植為主,這種治療方式常易導致供體部位的損傷及功能缺陷。隨著組織工程學的發(fā)展,體外構建的人工骨有望在不帶來嚴重并發(fā)癥的前提下徹底重建缺損的骨組織。 人工構建的骨組織通常由種子細胞和支架材料構成。羥基磷灰石(HAP)是構成人體硬組織,如牙齒、骨骼的無機成分。人工合成的羥基磷灰石由于與天然硬組織的化學成分相似,因而具有良好的生物相容性,已被許多研究用做構建

2、組織工程骨的支架材料。然而以前人工合成的HAP(cHAP)在顆粒大小與形態(tài)方面與天然羥基磷灰石迥然不同。天然骨組織中的羥基磷灰石以數(shù)十納米的晶體形式存在,而正是這些數(shù)十納米晶體的有序排列構成了骨組織的力學屬性[10]。以納米相羥基磷灰石(nHAP)為支架材料的組織工程骨有望獲得更好的超微結構上的生物模擬性和更優(yōu)異的骨傳導性。 骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是一類從骨髓中分離的具有強大增殖能力和多向分化能力的干細胞,在一定條件下可

3、分化為骨、軟骨、脂肪、肝、神經(jīng)、心肌等多種組織細胞。較胚胎干細胞具有無致瘤性、無倫理學爭議、免疫原性弱等優(yōu)點。較成骨細胞具有可獲得性良好及擴增能力強等優(yōu)點,因而被廣泛認為是骨組織工程種子細胞的理想來源。以骨髓間充質(zhì)干細胞和納米相羥基磷灰石復合構建的人工骨有望成為未來骨組織工程研究和應用的主流。 組織工程學的重要研究內(nèi)容之一是支架材料對種子細胞生物學行為的影響。目前nHAP對MSCs生長及分化的影響尚未得到充分闡明。本研究旨在詳細

4、闡述作為支架材料的nHAP對于種子細胞MSCs生長及成骨分化等生物學行為的影響。 實驗結果顯示,nHAP顆粒對MSCs的生長、分化、礦化等生物學行為具有廣泛的影響。nHAP顆粒對MSCs的生長的作用依劑量不同而有很大區(qū)別。nHgP劑量低于2μg/104 cells可顯著促進細胞生長,然而在無血清培養(yǎng)條件下這種促增殖作用消失。說明這種促進作用與nHAP的蛋白吸附功能有關。吸附血清蛋白的nHAP粘附于細胞表面,使細胞周圍產(chǎn)生局部性血

5、清蛋白濃度升高,從而有利于細胞生長。此外當采用插入式培養(yǎng)皿對細胞及顆粒進行分離式共培養(yǎng)時,這種促增殖作用也消失。說明顆粒與細胞的接觸對這種促增殖作用是必需的。也從另一個側面證實nHAP的蛋白吸附功能與其促細胞增殖作用有密切關系。當nHAP劑量高于20μg/104cells可顯著抑制細胞增殖。在無血清及分離式共培養(yǎng)條件下,這種抑制增殖作用同樣存在。說明這種抑制作用是通過顆粒改變培養(yǎng)液條件而產(chǎn)生的。對于細胞分化,nHAP顆?？娠@著促進MSC

6、s的成骨分化但卻顯著抑制細胞礦化,分離式共培養(yǎng)條件下產(chǎn)生同樣結果。說明這些作用同樣是通過顆粒改變培養(yǎng)液條件而產(chǎn)生的。nHAP對培養(yǎng)液條件的改變最有可能是改變其中的鈣磷濃度。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)nHAP可使培養(yǎng)液中的鈣磷濃度降低而不是升高。推測可能是nHAP顆粒在培養(yǎng)液中出現(xiàn)晶體生長而吸收鈣磷離子,從而降低Ca、P濃度。將MSCs種植于nHAP基質(zhì)表面,細胞同樣可貼壁、增殖與成骨分化。但其貼壁增殖與分化的特征與在普通培養(yǎng)基質(zhì)(孔板)上顯著不同。細胞

7、貼壁的速度與在孔板上相似,均于2h已出現(xiàn)貼壁,約16小時完成貼壁。但貼壁數(shù)量顯著少于孔板。約60％接種細胞可最終完成貼壁,而在普通孔板上約85％細胞可以完成貼壁。在增殖速度方面,nHAP上的細胞也比在孔板上的細胞慢,它們的倍增時間分別是110h Vs 60h。然而值得注意的是,盡管增殖速度較慢,nHAP上的細胞同樣可以長滿底面。因而MSCs在nHAP表面的增殖是可以滿足需要的。此外在nHAP上MSCs的成骨分化顯著增強。nHAP條件培養(yǎng)

8、液同樣可使MSCs成骨分化增強,說明是nHAP改變培養(yǎng)液條件從而促進MSCs成骨分化。此結果與前面實驗結果一致。 nHAP基質(zhì)與普通羥基磷灰石基質(zhì)(cHAP)在表面微地形、親水性、蛋白吸附、離子交換等特征方面有許多不同。與cHAP相比,nHAP基質(zhì)更有利于細胞貼壁和增殖。但細胞在兩種基質(zhì)上的成骨分化卻大致相當。但由于貼壁和增殖效率高,在接種等量細胞后,nHAP基質(zhì)上的細胞表達總蛋白、堿性磷酸酶、骨鈣素等的總量仍高于cHAP表面的

9、細胞。 nHAP可改變培養(yǎng)液中的鈣磷濃度。這種改變可能會導致細胞生長分化等生物學行為的改變。為此我們觀察了不同鈣磷濃度及其組合對MSCs增殖與成骨分化的影響。結果顯示,鈣磷濃度降低可抑制細胞增殖與分化,而不是促進細胞增殖與分化。當鈣濃度升高時,對細胞增殖沒有影響,但可促進細胞礦化抑制細胞分化。當磷濃度升高時,可抑制細胞生長但對成骨分化沒有顯著影響。這部分實驗表明,nHAP降低培養(yǎng)液中鈣磷濃度,可能是其抑制細胞生長與礦化的機理,但