轉(zhuǎn)染HIF-1α的骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合納米羥基磷灰石對兔橈骨骨缺損的修復(fù)作用.pdf

1、目的：
　　以骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）作為種子細胞，將攜帶低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的慢病毒感染BMSCs后與納米羥基磷灰石人工骨材料（Nano-HA）體外復(fù)合培養(yǎng)，植入兔橈骨骨缺損模型，觀察HIF-1α對骨缺損的修復(fù)作用。
　　方法：
　　用已構(gòu)建成功的HIF-1α慢病毒表達質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293Ta細胞，包裝出慢病毒并測出病毒滴度。取兔脛骨的骨髓，使用全骨髓貼壁篩選法結(jié)合密度梯度離心法分離培養(yǎng)BM

2、SCs，通過形態(tài)學(xué)觀察及流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)記物CD90、CD105、CD34、CD45對BMSCs進行鑒定。將攜帶HIF-1α慢病毒感染BMSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察感染效率。將感染攜帶HIF-1α慢病毒后的BMSCs與Nano-HA共培養(yǎng)得到HIF-1α-eGFP/BMSCs/Nano-HA人工骨材料，電鏡掃描法檢測BMSCs在Nano-HA支架的復(fù)合情況，沉淀法檢測細胞在支架上的黏附率，CCK-8法檢測支架上細胞增殖效率。將

3、體外復(fù)合培養(yǎng)后的人工骨材料植入兔橈骨骨缺損模型，使用新西蘭大白兔40只，隨機分為4組，每組10只：A組植入轉(zhuǎn)染HIF-1α的BMSCs與Nano-HA復(fù)合培養(yǎng)后的人工骨材料（HIF-1α-eGFP/BMSCs/Nano-HA組）、B組植入BMSCs與Nano-HA復(fù)合培養(yǎng)后的人工骨材料（BMSCs/Nano-HA組）、C組植入Nano-HA人工骨材料（Nano-HA組），D組不植入任何材料（空白組）。于手術(shù)后第4，8，12周分別檢測兔橈

4、骨大體標(biāo)本、X光、組織切片、生物力學(xué)性能并進行統(tǒng)計學(xué)分析，觀察比較橈骨缺損的愈合情況。
　　結(jié)果：
　　1、將攜帶HIF-1α慢病毒表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293Ta細胞48小時后，收取病毒后，用孔稀釋計數(shù)法計算出病毒滴度為5.0×107TU/ml。用流式細胞儀對細胞表面標(biāo)記物CD90、CD105和CD34、CD45進行檢測，CD90、CD105陽性率為99.3％，CD34、CD45為陰性。
　　2、BMSCs與Nano-HA共培

5、養(yǎng)：沉淀法檢測轉(zhuǎn)染HIF-1α后的BMSCs對Nano-HA材料黏附能力隨時間增加而增強；CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染HIF-1α基因后的BMSCs增殖速率變快，Nano-HA材料對BMSCs的增殖無明顯影響；電鏡掃描結(jié)果提示細胞在材料表面上生長良好，偽足伸展充分，并且相互連接成片。
　　3、動物實驗：在術(shù)后第4、8、12周分別對各組大體標(biāo)本、X線、組織切片、生物力學(xué)性能進行檢測，發(fā)現(xiàn)A組HIF-1α-eGFP/BMSCs/Nano-HA

6、復(fù)合人工骨、B組BMSCs/Nano-HA復(fù)合人工骨和C組Nano-HA人工骨均可促進骨缺損修復(fù)，但A組HIF-1α-eGFP/BMSCs/Nano-HA復(fù)合人工骨組的新骨形成量大，骨缺損修復(fù)能力明顯優(yōu)于后兩者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　BMSCs作為骨組織工程種子細胞參與成骨，HIF-1α基因促進BMSCs成骨、成血管分化，從而增強新生骨組織的形成能力，更有效地修復(fù)骨缺損，Nano-HA具有良好的