胰島素樣生長因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞定向分化.pdf

1、目的：
　　 1. 體外探討分離與培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的方法，并觀察其體外的多向分化與增殖能力以及其生物學(xué)特性，還對細胞表面干細胞相關(guān)標志物進行鑒定，為骨髓間充質(zhì)干細胞的進一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　 2. 探討胰島素樣生長因子和多種細胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞分化的可行性，實驗條件。并用激光共聚焦顯微鏡觀察分化細胞的陽性率，及形態(tài)學(xué)變化尋找最佳

2、的誘導(dǎo)條件，為獲得大量少突膠質(zhì)細胞移植修復(fù)脊髓損傷奠定基礎(chǔ)。
　　 3. 在實驗二的基礎(chǔ)上，觀察骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖分化過程，判斷IGF-1 在少突膠質(zhì)細胞分化中的那個環(huán)節(jié)起作用，尋找胰島素樣生長因子和多種細胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞分化的作用機制，并給予一定的干預(yù)措施，進一步予以證實。
　　 方法：
　　 1. 取原代細胞后，用貼壁篩選法和胰蛋白酶消化法分離純化，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及

3、生長特征，研究其增殖過程，繪制出生長曲線，采用免疫組化法對細胞表面干細胞標志CD44 進行鑒定，對第4 代細胞分別用成骨，成軟骨，成脂肪和成神經(jīng)誘導(dǎo)劑培養(yǎng)，行堿性磷酸酶染色，Van kossa 銀染色法，Ⅱ型膠原免疫組化染色，油紅O 染色，NeuN 抗體免疫組化染色以及形態(tài)學(xué)觀察，證實其干細胞的多向分化潛能。
　　 2. 選取生長良好的第4 代骨髓間充質(zhì)干細胞，胰酶消化后，離心加入誘導(dǎo)液，轉(zhuǎn)移至含有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，細胞數(shù)為11

4、0 4個/cm2，放入體積分數(shù)為0.05的CO2 孵箱中培養(yǎng)48h后，誘導(dǎo)組細胞更換培養(yǎng)液，用含不同濃度IGF-1的分化培養(yǎng)液培養(yǎng)3d后，觀察骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)學(xué)變化，收取細胞進行特異性標志物大鼠磷脂堿性蛋白（MBP）、半乳糖腦苷脂(Glac)、半定量RT-PCR（semi-quatitative reverse transctiption-polymerase chain reaction）檢測，Wes

5、tern-blot 測定大鼠磷脂堿性蛋白（MBP）含量，免疫細胞化學(xué)染色后激光共聚焦顯微鏡檢測骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞定向分化的陽性率。并篩選出最佳IGF-1(Insulin growthfactor-1)濃度劑量的分化培養(yǎng)液。
　　 3. 根據(jù)BMP2(bone morphogenetic proteins）在少突膠質(zhì)細胞的形成中起抑制作用，少突膠質(zhì)細胞的成熟需要BMP信號的抑制劑，為了獲得IGF-1誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細胞分化

6、的分子機制，我們推斷IGF-1的影響是通過抑制BMP2信號通路。我將分化培養(yǎng)液中加入不同劑量的BMP2 培養(yǎng)3天，收取細胞進行特異性標志物大鼠磷脂堿性蛋白（MBP）、半乳糖腦苷脂(Glac)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、微管相關(guān)蛋白－2（MAP-2）半定量RT-PCR檢測，并進行統(tǒng)計學(xué)處理，免疫細胞化學(xué)染色后激光共聚焦顯微鏡檢測骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞定向分化的陽性細胞百分比。
　　 結(jié)果：
　　 1.所分離培養(yǎng)

7、的細胞形態(tài)呈長梭形或多邊形，細胞生長曲線呈S形，群體倍增時間約為31 小時，經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)2 周后，堿性磷酸酶染色成陽性，Van kossa 銀染色法陽性表明該細胞可向成骨方向分化，經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)2 周后，Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性，表明該細胞可向成軟骨方向分化，而分離培養(yǎng)的細胞經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)2 周后，油紅O 染色可見顯微鏡下大量細胞內(nèi)充滿紅色脂肪滴，表明該細胞可向脂肪細胞方向分化，所培養(yǎng)的細胞經(jīng)化學(xué)性神經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)

8、培養(yǎng)8 小時后，NeuN 抗體免疫組化染色陽性,細胞呈神經(jīng)元樣形態(tài)表現(xiàn)，表明該細胞可向神經(jīng)細胞方向分化。
　　 MSCs 抗原CD34免疫細胞化學(xué)染色呈陰性反應(yīng)，CD44免疫細胞化學(xué)染色見鏡下有棕黃色顆粒沉積。以上結(jié)果提示，用貼壁篩選法所分離培養(yǎng)的細胞為具有多向分化潛能的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　 2. ①骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)學(xué)變化：經(jīng)誘導(dǎo)分化后，大部分骨髓間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出少突膠質(zhì)細胞的

9、形態(tài)學(xué)特征，胞質(zhì)向細胞核回縮，細胞突起向外延伸，折光性增強，隨時間延長多個細胞突起相互連接形成典型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。②少突膠質(zhì)細胞特異性標志物mRNA的表達：細胞誘導(dǎo)分化后可檢測到磷脂堿性蛋白mRNA、半乳糖腦苷脂mRNA的特異性條帶。③少突膠質(zhì)細胞陽性率：在誘導(dǎo)分化條件下，半乳糖腦苷脂陽性率為65%，磷脂堿性蛋白陽性率為45%，微管相關(guān)蛋白2陽性率為10%。比較含不同IGF-1 濃度的分化培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)含500μg/L IGF-1濃度的培養(yǎng)液

10、少突膠質(zhì)細胞標志物陽性率最高。④Western-blot檢測磷脂堿性蛋白表達水平明顯增高，以含500μg/L IGF-1濃度的培養(yǎng)液分化組最為明顯。
　　 3. 在分化培養(yǎng)液中加入不同濃度的BMP2，發(fā)現(xiàn)向少突膠質(zhì)細胞的分化明顯受到抑制，僅部分骨髓間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出少突膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)特征，與BMP2的濃度成依賴關(guān)系，濃度越高（5μg/L)少突膠質(zhì)細胞標志物(Glac,MBP)的陽性細胞越少，收取細胞進行特異性標志物大鼠磷脂堿性

11、蛋白（MBP）、半乳糖腦苷脂(Glac)半定量RT-PCR檢測，未檢查出特異性條帶。在低濃度（0.05μg/L-0.5μg/L）的情況下，可以觀察到部份細胞向少突膠質(zhì)細胞分化，這個結(jié)果與BMPs 抑制少突膠質(zhì)分化的特性相一致。
　　 結(jié)論：
　　 1. 通過取大鼠骨髓組織培養(yǎng)，用貼壁篩選法和胰蛋白酶消化法分離純化，可以分離出穩(wěn)定的含CD44 抗原的有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細胞，該細胞不斷可以向中胚層成細胞分化，而且可

12、以向外胚層神經(jīng)細胞分化，取材方便，容易獲得是體外研究干細胞定向分化的理想細胞。
　　 2. 合適的培養(yǎng)基和一定濃度的IGF-1 有利于骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞定向分化，該結(jié)果通過探討誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞分化的可行性，實驗條件，為以后的間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞的定向分化移植治療脊髓損傷打下基礎(chǔ)。
　　 3. 胰島素樣生長因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向少突膠質(zhì)細胞定向分化，其主要作用機理是通過抑制少突膠質(zhì)細