miR-24在人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：miRNA(microRNA)是一些長(zhǎng)度很短的非編碼RNA，通過(guò)降低靶基因的穩(wěn)定性或抑制其翻譯水平來(lái)影響細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。最近有研究表明miRNA對(duì)于成骨起到重要作用。關(guān)于其在成骨發(fā)生發(fā)展中所起的作用，已經(jīng)日益成為研究的熱點(diǎn)。前期課題已經(jīng)檢測(cè)DISH患者黃韌帶中miR-24表達(dá)較正常人黃韌帶水平下降，并預(yù)測(cè)其靶基因?yàn)門(mén)cf-1。本課題研究miR-24在BMP-2誘導(dǎo)下人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hMSCs)向成骨細(xì)胞分化中的作用，

2、驗(yàn)證其靶基因Tcf-1，闡明miR-24促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨化機(jī)制。
　　方法：體外分離人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，在體外擴(kuò)增傳代培養(yǎng)，觀察其形態(tài)特點(diǎn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)第六代的、已純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。BMP-2誘導(dǎo)hMSCs成骨分化，Northernblot技術(shù)檢測(cè)miRNA-24在此過(guò)程中的表達(dá)模式。設(shè)置BMP-2(+)與BMP-2(-)對(duì)照組，miR-24、anti-miR-24與miR-NC分別脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hM

3、SCs)。ALP活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性，加入經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液后用茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)。Westernblot檢測(cè)不同時(shí)間Tcf-1蛋白和Runx2蛋白變化，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Tcf-1mRNA表達(dá)的變化。構(gòu)建野生型、突變型、缺失型Tcf-1熒光素酶報(bào)告基因載體，分別與miR-24或miR-NC共同轉(zhuǎn)染hMSCs，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法驗(yàn)證miR-24對(duì)靶基因Tcf-1的直接調(diào)控作用。
　　結(jié)果：經(jīng)過(guò)分離、培養(yǎng)的人骨髓間充

4、質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)多次傳代后，細(xì)胞逐漸純化，并且細(xì)胞初期多以集落形式增長(zhǎng)，第6代后細(xì)胞曾形態(tài)均一的紡錘形，分布均勻。流式細(xì)胞儀檢測(cè)符合人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。隨著B(niǎo)MP-2誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-24表達(dá)逐漸降低。在BMP-2誘導(dǎo)下，ALP活性增加，轉(zhuǎn)染miR-24過(guò)表達(dá)降低ALP活性。轉(zhuǎn)染miR-24后基質(zhì)鈣結(jié)節(jié)減少。RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染miR-24后Tcf-1mRNA無(wú)明顯改變。Western印跡顯示轉(zhuǎn)染miR-24后Tcf-1蛋白

5、及Runx2蛋白表達(dá)下降。miR-24與野生型、突變型熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性顯著下降(p<0.05)，而轉(zhuǎn)染突變型及缺失型熒光素酶活性則無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：1.分離、培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)正常，符合人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。2.在BMP-2誘導(dǎo)下，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，miR-24隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。3.在BMP-2誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染miR-24后，Tcf-1蛋白與Runx2蛋白水平下降，Tcf-1mR