低能量激光對(duì)骨髓來源干細(xì)胞成骨分化過程基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 近些年，低能量激光照射(lowlevellaserirradiation，LLLR)陸續(xù)被報(bào)道具有良好的生物學(xué)作用，包括光生物學(xué)促進(jìn)作用、光生物學(xué)調(diào)節(jié)功能等。通過文獻(xiàn)回顧可知，LLLR不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞代謝和細(xì)胞增殖，而且可以調(diào)節(jié)新生血管的生成、改善炎癥狀態(tài)。另外，實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果顯示，通過照射LLLR成骨細(xì)胞的增殖以及成骨分化增加;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，照射低能量激光可以提高牙齒移動(dòng)速度，促進(jìn)骨折區(qū)新生骨生成，

2、加速骨愈合，另外可以降低疼痛。低能量激光所指指的可見紅光和紅外光，穿透能力較強(qiáng)，產(chǎn)熱較少，照射過程中熱損傷效應(yīng)比較低。低能量激光廣泛的生物學(xué)作用以及創(chuàng)傷、疼痛等副作用少，可以對(duì)治療某些疾病產(chǎn)生優(yōu)越的作用。但是不同的文獻(xiàn)對(duì)于低能量激光對(duì)成骨過程的具體影響闡述并不完全一致，甚至呈現(xiàn)相反的效應(yīng)模式;對(duì)于成骨分化過程中的人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells，hBMSCs)受到LLLR照射

3、后其具體的生物學(xué)效用如何，LLLR通過何種生物學(xué)機(jī)制發(fā)揮作用，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道不一。基于前期的實(shí)驗(yàn)報(bào)道回顧以及合理的實(shí)驗(yàn)因素控制，設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。本研究通過分離人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞，探究分離以及培養(yǎng)該細(xì)胞的正確方法，摸索科學(xué)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑BMSCs細(xì)胞系，為將來與hBMSC相關(guān)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目做好細(xì)胞儲(chǔ)備。
　　 利用635nm可見紅光(visiblered，VR)和808nm紅外光(invisiblered,IR)兩種不同波長(zhǎng)的低

4、能量激光，利用而激光管將低能量激光作為實(shí)驗(yàn)因素導(dǎo)入，通過改變光照時(shí)間調(diào)節(jié)光照計(jì)量，探究人骨髓來源的干細(xì)胞在不同劑量不同波長(zhǎng)的低能量激光照射下的反應(yīng)，使用基因芯片技術(shù)(Microarray)篩選LLLR可以調(diào)節(jié)的成骨相關(guān)基因以及細(xì)胞信號(hào)通路，之后運(yùn)用RT-PCR技術(shù)、western技術(shù)等在RNA水平、蛋白水平分析驗(yàn)證成骨性基因的表達(dá)與激光照射之間是否存在如Microarray所示的關(guān)系，探究LLLR調(diào)節(jié)hBMSC成骨分化過程中基因表達(dá)的具

5、體機(jī)制，為解釋LLLR可以促進(jìn)正畸治療過程中的牙齒移動(dòng)以及成骨愈合提供新的證據(jù)和更好的解釋。
　　 方法:
　　 1、利用密度梯度離心法分離人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（新鮮人長(zhǎng)骨骨髓購(gòu)買于生物公司），并進(jìn)行常規(guī)貼壁培養(yǎng)，P3～P5細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)中。部分早期細(xì)胞(Pl～P3)進(jìn)行低溫冷凍儲(chǔ)存于液氮罐中以備后期實(shí)驗(yàn)使用。
　　 2、第二實(shí)驗(yàn)階段，復(fù)蘇凍存BMSCs細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)細(xì)胞所使用的常規(guī)培養(yǎng)液更換為成骨誘

6、導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)2week，每隔1至2天換液一次。初次換液后即刻對(duì)細(xì)胞進(jìn)行LLLR照射處理。低能量激光波長(zhǎng)分別為635nm，808nm，照射劑量分別為0.5J/cm2，1.0J/cm2，1.5J/cm2，2.0J/cm2，計(jì)8個(gè)實(shí)驗(yàn)組;另外BMSCs無光照處理組為對(duì)照組，共9組。加入誘導(dǎo)液2周后，收集被誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞，應(yīng)用基因芯片技術(shù)（Microarray技術(shù)）檢測(cè)外顯子水平上不同條件下各種基因的表達(dá)差異，篩選受LLLR影響其表達(dá)與對(duì)照

7、相比呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)性差異的基因，探究骨相關(guān)基因在激光照射下的表達(dá)差異。
　　 3、基于Microarray的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)條件，采用808nm激光以及0，0.5J/cm2，2.0J/cm2三種激光劑量，利用RT-PCR和western技術(shù)驗(yàn)證其成骨過程相關(guān)基因表達(dá)和蛋白合成的差異，以驗(yàn)證低能量激光對(duì)干細(xì)胞成骨基因分化表達(dá)的影響作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、從新鮮長(zhǎng)骨骨髓中成功分離出人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并子啊實(shí)驗(yàn)室建

8、立該細(xì)胞系，部分早期hBMSCs細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?br>　　 2、通過收集9種條件下各個(gè)實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組的全細(xì)胞RNA，利用基因芯片技術(shù)分析外顯子水平的基因表達(dá)情況?？芍?，不同波長(zhǎng)、不同照射計(jì)量的激光對(duì)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程的基因表達(dá)影響不同，隨著改變激光照射條件，基因表達(dá)呈現(xiàn)明顯劑量依賴性，其中RANKL、IL-6、OPG、CTSK等基因的差異最為明顯，且在紅外波段表現(xiàn)出線性特點(diǎn)。同時(shí)，由基因芯片專業(yè)軟件繪制信號(hào)通路圖譜分析

9、，不論635nm波段還是808nm波段的激光處理，均可以對(duì)不同的信號(hào)通路產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，有的呈現(xiàn)因激光照射表達(dá)增加的上調(diào)效應(yīng)，有的則呈現(xiàn)下調(diào)效應(yīng)表達(dá)相應(yīng)的減少;尤其以紅外波段808nm激光照射條件下，TGF-β1信號(hào)通路的上調(diào)效應(yīng)最為顯著，
　　 3、基于基因芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，紅外波段激光照射生物學(xué)效應(yīng)較可見光波段更為明顯。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，LLLR對(duì)不同基因的表達(dá)調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)線性調(diào)節(jié)作用，故而選用0.5J/cm2，2.0J/cm

10、2兩個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量以及0J/cm2作為空白對(duì)照設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，處理成骨誘導(dǎo)過程中的hBMSCs，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于不同的激光照射劑量，除了OCN、RANKL兩種基因的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組內(nèi)部不存在統(tǒng)計(jì)性差異以外，Runx2、ALP、OCN以及RANKL的表達(dá)任兩組間相比較即存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，照射時(shí)間增加激光的正向調(diào)節(jié)更為明顯。蛋白水平上，Western實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證808nm的低能量激光對(duì)骨相關(guān)基因具有明顯的上調(diào)作用，與RT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果相

11、一致，共同驗(yàn)證了808nm特定波長(zhǎng)的激光能夠促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、特定波長(zhǎng)特定能量的低能量激光照射，都可以激發(fā)一系列不同的基因差異性表達(dá)。在眾多的基因中，部分基因可以對(duì)各種不同條件激光的照射均產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng);部分則只能對(duì)某種特定激光照射條件有反應(yīng)。類似的是，另有部分基因在不同激光劑量的條件下，也存在互相重疊的現(xiàn)象。
　　 2、808nm的紅外波長(zhǎng)條件下，在一定的激光劑量?jī)?nèi)，組織再生相關(guān)基

12、因呈現(xiàn)出照射劑量依賴性特征，而這一特點(diǎn)在具有反向調(diào)節(jié)作用的基因表達(dá)上特征不明顯。Ingenuity軟件分析，基因之間相互調(diào)節(jié)各種作用互相交叉，激光照射可以起到各個(gè)通路的調(diào)控作用，包括上調(diào)和下調(diào)。
　　 3、808nm紅外光譜照射后，BMSCs細(xì)胞誘導(dǎo)成骨過程中，其成骨相關(guān)基因以及破骨相關(guān)基因表達(dá)都有增加，進(jìn)一步證明激光對(duì)于成骨、破骨過程的生物學(xué)調(diào)控作用。但是鑒于實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)以及時(shí)間的限制，尚且無法得出確定性結(jié)論激光如何準(zhǔn)確的調(diào)控成