低能量激光照射對(duì)受牽張力刺激的人牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、目的：建立人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells hPDLCs）體外張應(yīng)力加載模型，探討弱激光照射（low level laser irradiation，LLLI)對(duì)受張應(yīng)力刺激的hPDLCs成骨分化的影響，為揭示LLLI促進(jìn)正畸牙移動(dòng)的分子生物學(xué)機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、取臨床健康青少年(12-16歲)因正畸治療需要拔除的雙尖牙根中1/3牙周膜組織，通過(guò)組織塊結(jié)合酶消

2、化法對(duì)hPDLCs進(jìn)行原代分離培養(yǎng)，常規(guī)的換液、消化、傳代，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)。取第三代細(xì)胞用于細(xì)胞來(lái)源的鑒定，第四代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)中。
　　2、人牙周膜細(xì)胞應(yīng)力及激光加載實(shí)驗(yàn)：取第四代細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，分為三組，即A組（空白組）、B組（張應(yīng)力加載組）和C組（弱激光照射并張應(yīng)力加載組），接種于6孔板中。A組細(xì)胞既不加力也不照射；B組細(xì)胞分別給予2h、6h、12h、24h的10％周期性張應(yīng)力刺激；C組細(xì)胞先進(jìn)行2s、5s激光照射，再分

3、別進(jìn)行2h、6h、12h、24h的周期性張應(yīng)力加載。
　　3、提取各組細(xì)胞的總RNA和總蛋白，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)技術(shù)（qRT-PCR）和免疫印跡（Western Blotting）檢測(cè)技術(shù)，對(duì)各組成骨分化指標(biāo)ALP、Runx2、OCN進(jìn)行基因及蛋白檢測(cè)。
　　4、應(yīng)用SPSSl7.0醫(yī)用統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s）表示。應(yīng)用方差分析的統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)A組、B組、C組各指標(biāo)的mRNA和蛋白表達(dá)量

4、差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；使用LSD-t檢驗(yàn)方法進(jìn)行均數(shù)間的兩兩比較，以p<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、hPDLCs鑒定:鏡下觀察，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，排列成放射狀或是漩渦狀。細(xì)胞抗波形絲蛋白染色陽(yáng)性，抗角蛋白染色陰性，說(shuō)明所得細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源。
　　2、qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:不同的加力時(shí)間段，不同的激光照射劑量條件下，ALP、Runx2、OCN的mRNA表達(dá)量A組、B組、C組任兩組間比較差異有顯著性（p

5、<0.05）。C1、C2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），隨加力時(shí)間延長(zhǎng)，激光照射時(shí)間增加，mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　3、Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示:ALP、Runx2、OCN的蛋白表達(dá)量隨加力時(shí)間和激光照射時(shí)間增加而增加，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；C1、C2組蛋白表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。A組、B組、C組蛋白表達(dá)量結(jié)果與mRNA表達(dá)趨