拉伸刺激對脂肪源干細胞成骨誘導(dǎo)的影響.pdf

1、背景:原林教授提出的“筋膜學(xué)假說”認為人體是由尚未分化的非特異性結(jié)締組織(筋膜)支架所構(gòu)成的支持與儲備系統(tǒng)和以已分化功能細胞為基礎(chǔ)的功能系統(tǒng)所共同構(gòu)成。功能系統(tǒng)在支持與儲備系統(tǒng)支持下維持結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定,支持與儲備系統(tǒng)不斷的為功能系統(tǒng)的細胞更新和功能活動提供源源不斷的細胞源泉和細胞活動所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。功能系統(tǒng)是建立在功能細胞的專能特化基礎(chǔ)上的,而支持與儲備系統(tǒng)的筋膜支架是以干細胞為核心,通過分化出各種定向干細胞,為功能系統(tǒng)的更新提供源

2、源不斷的細胞補充,并為功能系統(tǒng)的各種細胞的更新、代謝提供一個穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。
　　 間充質(zhì)干細胞(menchymal stem cells)具有自我更新、多向分化的能力。最初是由Friendenstein等發(fā)現(xiàn),且證明其在體外可以分化成為成骨細胞及脂肪細胞,而后其它的研究小組發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs不僅可以分化為中胚層來源的組織,而且可以分化為內(nèi)胚層和外胚層來源的組織。間充質(zhì)干細胞的多組織來源與筋膜結(jié)締組織支架的全身分布是一致的,

3、其縱向、橫向分化的生物學(xué)特性與筋膜學(xué)提出的筋膜結(jié)締組織對機體的支持儲備作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干細胞的一種儲備形式。ADSCs具有多分化潛能,能夠跨胚層分化。ADSCs具有低免疫原性,免疫調(diào)節(jié)功能和分泌細胞因子等能力為異體移植提供了有利條件,使ADSCs成為生物治療的亮點之一；ADSCs分泌細胞因子抗老化的作用,已經(jīng)被臨床廣泛應(yīng)用。ADSCs不僅可以用來進行各種退行性和衰竭疑難病的替代治療,而且可用來進行輔助的免疫治療。

4、ADSCs可能通過以下機制修復(fù)或者重建組織:首先,ADSCs被植入一個受損的或是壞死的組織,它們能以副分泌的方式分泌出細胞活素和生長因子以刺激修復(fù)。ADSCs可以提供抗氧化劑、自由基清除劑、熱休克蛋白等給待修復(fù)組織,從而清除局部環(huán)境中所釋放的有毒物質(zhì),促進仍存活的細胞的修復(fù)。另外,ADSCs可以通過刺激內(nèi)生性干細胞補充到待修復(fù)的臟器或自身直接遷移補充到待修復(fù)區(qū)域,以調(diào)節(jié)干細胞的微環(huán)境,并且促進它們沿著需要的方式分化為功能細胞,從而更新機

5、體衰老的功能細胞,維持機體平衡。
　　 組織和細胞的生理行為是受到物理刺激和化學(xué)因素等調(diào)控的。對骨組織的研究表明,適宜的力學(xué)刺激可引起骨質(zhì)量和骨密度的增加,而長期的失重或臥床則能導(dǎo)致骨質(zhì)量的損失。此外由于在不同的力學(xué)條件下,骨細胞數(shù)量和基質(zhì)合成能力發(fā)生變化、從而引起骨的內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。許多離體實驗已證實,應(yīng)力的種類、頻率、大小和時間等諸多因素都會影響成骨細胞的生化響應(yīng)。
　　 目的
　　 1.分離培養(yǎng)SD大鼠的AD

6、SCs,并進行表面標志CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106的檢測,進行成骨成脂誘導(dǎo)檢測多向分化能力。
　　 2.對SD大鼠和Wistar大鼠的腹股溝皮下脂肪墊進行ADSCs體外分離培養(yǎng),并進行成脂肪誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)分化,比較2種常用大鼠ADSCs的誘導(dǎo)分化能力,為進一步利用ADSCs進行相關(guān)研究和應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 3.為了探討拉伸刺激對ADSCs增殖和生長的影響,本實驗應(yīng)用計算機控制的Fle

7、xcell FX-5000柔性基底加載系統(tǒng)探討低頻率拉伸刺激對ADSCs成骨定向誘導(dǎo)過程的增殖動力學(xué)變化,為深入研究力學(xué)信號對ADSCs增殖、生長、分化等的調(diào)控提供初步的實驗資料。
　　 方法
　　 1.取成年大鼠腹股溝脂肪墊,酶消化法分離、培養(yǎng)筋膜結(jié)締組織脂肪源干細胞。通過形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、流式細胞術(shù)鑒定非特異性筋膜結(jié)締組織源細胞是否符合間充質(zhì)干細胞的特性,以判斷非特異性筋膜結(jié)締組織中是否含有間充質(zhì)干細胞。
　　

8、 2.無菌條件下取SD大鼠和Wistar大鼠腹股溝脂肪墊,分離培養(yǎng)脂肪源干細胞。分別取兩種來源的第4代ADSCS進行成骨和成脂誘導(dǎo)分化。
　　 3.取第4代ADCSs接種于被Ⅰ型膠原的Bioflex6孔培養(yǎng)板上,用骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)；拉伸組和實驗對照組均分別每天拉伸加載刺激,其余時間放在同一普通培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),空白對照組不進行拉伸刺激和成骨誘導(dǎo)。分別在2d、4d、8d、16d加載后酶標儀法檢測各組ADSCs的堿性磷酸酶(AKP)活

9、性。分別在2d、4d、8d、16d加載后各組培養(yǎng)孔堿性磷酸酶(AKP)重氮鹽法染色。
　　 結(jié)果
　　 1.非特異筋膜結(jié)締組織源細胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學(xué)特征,可以形成細胞集落,體外誘導(dǎo)可以分化成成骨細胞、脂肪細胞。
　　 2.兩個種屬的大鼠均能獲得ADSCs,原代細胞和傳至4代細胞在倒置顯微鏡下觀察,形態(tài)無明顯差異。對SD大鼠和Wistar大鼠腹股溝脂肪墊第4代的ADSCs進行成骨和成脂誘導(dǎo)分化,經(jīng)誘導(dǎo)后都

10、能向成骨細胞和脂肪細胞轉(zhuǎn)化。
　　 3.牽拉后第2天細胞的AKP活性即高于空白對照組。隨著細胞數(shù)目的增加,AKP活性相應(yīng)增強,細胞數(shù)目達高峰后；AKP活性趨于平穩(wěn)。拉伸組堿性磷酸酶染色陽性細胞在拉伸刺激后明顯多于實驗對照組,但隨著誘導(dǎo)時間的延長,拉伸組AKP染色陽性細胞的數(shù)目與實驗對照組變得接近,但均高于空白對照組。
　　 結(jié)論
　　 1.筋膜結(jié)締組織脂肪源干細胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學(xué)特征,可以形成細胞集落,

11、與其它組織來源間充質(zhì)干細胞無明顯差別;細胞表面標記物檢測中,4代貼壁ADSCs特異性表面標志物CD90、CD29表達率分別為90％以上,而CD49d、CD11b、CD45陰性表達,而CD106弱表達陽性；該細胞經(jīng)定向誘導(dǎo)后可以成骨、成脂肪,與間充質(zhì)干細胞多向分化的功能一致?？梢耘袛嘣诎l(fā)育成熟大鼠的筋膜結(jié)締組織中存在未分化間充質(zhì)干細胞。
　　 2.從SD大鼠和Wistar大鼠腹股溝脂肪墊獲取的ADSCs均具有向成骨和成脂肪分化能力

12、,從兩種品系大鼠皮下能獲得穩(wěn)定的原代ADSCs后,均能迅速擴增獲得大量成體干細胞,采用SD大鼠或者Wistar大鼠獲取ADSCs均是可行的。
　　 3.拉伸應(yīng)力刺激能促進體外培養(yǎng)ADSCs向成骨方向分化的激活、增殖及堿性磷酸酶的分泌,也就是說拉伸應(yīng)力可以促進ADSCs向成骨方向分化。拉伸組堿性磷酸酶染色陽性細胞在拉伸刺激后明顯多于對照組,但隨著誘導(dǎo)時間的延長,拉伸組AKP染色陽性細胞的數(shù)目與實驗對照組逐漸接近,但均高于空白組,具