不同方法制備PRP對(duì)脂肪干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響.pdf

1、目的：富血小板血漿(Platelet-Rich Plasma, PRP)為自體全血利用梯度離心原理離心獲得的血小板濃縮物，由激活劑或物理因素激活后能釋放多種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。以上這些細(xì)胞因子在特定條件下能夠誘導(dǎo)促進(jìn)多種細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生遷移、分化和增殖，參與傷口愈合中新生血管的形成以及骨的再生；而激活后的PRP呈凝膠狀，纖維黏連蛋白、富

2、含纖維蛋白等蛋白質(zhì)，可以作為天然的三維支架材料供細(xì)胞生長(zhǎng)，為組織的再生創(chuàng)造優(yōu)良的局部微環(huán)境。目前關(guān)于PRP的制備方法的文獻(xiàn)報(bào)道很多，研究發(fā)現(xiàn)不同的制備方法會(huì)影響到最終 PRP中血小板以及生長(zhǎng)因子的濃度，影響其作用效果的發(fā)揮。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）為近年來由脂肪組織中分離出的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在特定條件誘導(dǎo)下可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞分化。自

3、體ADSCs由于其取材方便，體外擴(kuò)增速度快等特點(diǎn)，可以作為組織工程技術(shù)中優(yōu)秀的種子細(xì)胞，用于組織器官的修復(fù)再生。盡管以往的研究證實(shí)PRP可以對(duì)多種細(xì)胞起作用，但關(guān)于PRP對(duì)ADSCs的研究較少。本研究采用三種不同方法制備PRP，比較PRP產(chǎn)物中血小板濃度以及生長(zhǎng)因子釋放量的差別；并將PRP和ADSCs共培養(yǎng)，分析PRP對(duì)ADSCs增殖和成骨分化的影響，探討PRP+ADSCs復(fù)合材料用于組織工程技術(shù)的可能性，為以后的臨床研究打下基礎(chǔ)。

4、r>　　方法：
　　1.本研究采用了傳統(tǒng)的二次離心法、三次離心法以及Tubex改良法制備PRP，通過血小板計(jì)數(shù)比較三種方法制備PRP的血小板采集率的大??；
　　2.通過酶消化組織塊法分離出兔脂肪干細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)、茜素紅染色和油紅O染色方法鑒定細(xì)胞；
　　3.將三種方法制備的PRP激活后配成5%濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，與上述的脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)，通過CCK-8試劑盒檢測(cè)PRP對(duì)細(xì)胞增殖的影響；
　　4.將三種方法制

5、備的5%PRP培養(yǎng)液處理細(xì)胞，通過茜素紅染色、堿性磷酸酶染色和定量、RT-PCR檢測(cè)PRP對(duì)脂肪干細(xì)胞成骨分化能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.血小板計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tubex改良法制備的PRP血小板回收率顯著高于其他兩種方法，PRP中的生長(zhǎng)因子濃度也明顯高于二次離心法和三次離心法。
　　2.本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過酶消化法獲得的細(xì)胞表面特定抗原的表達(dá)與脂肪干細(xì)胞一致，且具備成骨分化和成脂分化能力，符合脂肪干細(xì)胞特征。
　　3.

6、在培養(yǎng)21d后，所有PRP處理組的脂肪干細(xì)胞均觀察到了礦化結(jié)節(jié)的形成，細(xì)胞的堿性磷酸酶活性也顯著高于礦化誘導(dǎo)液處理的細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)定量 PCR觀察到脂肪干細(xì)胞成骨分化標(biāo)記基因的表達(dá)也明顯高于礦化誘導(dǎo)組。通過比較三種PRP對(duì)脂肪干細(xì)胞成骨分化的影響，我們發(fā)現(xiàn)Tubex法制備的PRP對(duì)脂肪干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用要強(qiáng)于其他兩種方法制備的PRP。
　　結(jié)論：綜合以上研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)Tubex法制備的PRP中血小板的含量以及生長(zhǎng)因子的濃