MIP-3α聯(lián)合成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、因齲齒或牙周疾病導(dǎo)致的牙齒缺失是人群中的常見病、多發(fā)病，世界衛(wèi)生組織（WHO）將牙齒疾病列為人類發(fā)病率最高的三大非傳染性疾病之一。臨床常用的修復(fù)牙齒缺失的方法，如人工材料替代缺失牙齒等，會(huì)引起包括免疫排斥在內(nèi)的諸多不良反應(yīng)。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展為牙齒再生提供了新的思路。牙髓干細(xì)胞（DPSCs）、牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）、牙囊干細(xì)胞（DFSCs）、根尖乳頭干細(xì)胞（SCAP）、人類脫落乳牙干細(xì)胞（SHEDs）等牙源性干細(xì)胞均表現(xiàn)出了

2、良好的牙向分化潛能，可用作牙齒組織工程的種子細(xì)胞，但因其在成人尤其是老年人中來源有限，限制了臨床應(yīng)用；非牙源性干細(xì)胞，如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSC），亦能夠形成牙齒樣及牙周樣組織，但其在臨床獲取相對(duì)不便，且BMSC隨著供體年齡增加其多項(xiàng)分化能力明顯下降，亦存在著諸多不利因素，制約了其在牙齒再生領(lǐng)域的應(yīng)用。
　　脂肪干細(xì)胞（ASC）來源廣泛，取材方便，含量豐富，在體內(nèi)及體外試驗(yàn)中均顯示出了良好的自我更新及多向分化潛能，并且其向礦化組織

3、分化的能力不受供體年齡的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)首先在體外分離、培養(yǎng)并鑒定了大鼠脂肪干細(xì)胞，然后探討了其向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的可能性及其條件，以期為牙齒組織工程種子細(xì)胞的研究提供新的思路。
　　方法
　　1.原代分離培養(yǎng)SD大鼠脂肪干細(xì)胞，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。將原代細(xì)胞培養(yǎng)傳代純化至第三代后采用MTT法測(cè)細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　2.取第三至四代生長狀態(tài)良好的大鼠脂肪干細(xì)胞，

4、TNE消化收獲細(xì)胞，接種于6孔板。分別以成骨及成脂誘導(dǎo)基誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞骨向及脂向分化。而后進(jìn)行ALP染色、茜素紅染色及油紅O染色實(shí)驗(yàn)。
　　3.消化收獲第三至四代生長狀況良好的大鼠脂肪干細(xì)胞，接種后用MIP-3α聯(lián)合成骨誘導(dǎo)基誘導(dǎo)。分別于第1、4、7天行ALP活性檢測(cè)，并以PR-PCR及WestenBlotting檢測(cè)成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因及蛋白。以常規(guī)培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基做為對(duì)照組。
　　結(jié)果
　　1.大鼠脂肪干

5、細(xì)胞生長狀態(tài)良好，MTT法測(cè)細(xì)胞生長曲線顯示大致“S”型。表面標(biāo)志物CD29+、CD49d+、CD45-。
　　2.成骨誘導(dǎo)顯示2周時(shí)光鏡下可見部分細(xì)胞向心性聚集生長，胞質(zhì)內(nèi)可見高透光結(jié)節(jié)狀顆粒。ALP染色可見胞核周圍棕黑色顆粒。3周時(shí)茜素紅染色可見紅色鈣化結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)顯示1周時(shí)細(xì)胞周圍可見散在脂滴，并不斷增大。3周時(shí)油紅O染色可見胞質(zhì)分布大量紅色大小不一的圓形脂滴，胞核藍(lán)染位于細(xì)胞一側(cè)。成骨及成脂誘導(dǎo)表明本實(shí)驗(yàn)使用的大鼠脂肪干

6、細(xì)胞具有多項(xiàng)分化潛能。
　　3.成牙本質(zhì)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，大鼠脂肪干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后ALP活性增高，且在mRNA水平表達(dá)成牙本質(zhì)標(biāo)志基因及蛋白，高于成骨誘導(dǎo)液組（P<0.05）；并且表達(dá)量隨時(shí)間的推移而增加(P<0.05)。常規(guī)培養(yǎng)基組無成牙本質(zhì)標(biāo)志基因及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論
　　1.大鼠脂肪干細(xì)胞原代分離培養(yǎng)成功，具有良好的生長趨勢(shì)及自我更新能力。CD29+、CD49d+、CD45-提示本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為比較單一的未分化的脂