遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅰ型牙囊干細(xì)胞成骨-成牙骨質(zhì)分化能力的體外研究.pdf

1、背景與目的：
　　遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅰ型（Dentin dysplasia typeⅠ，DD-Ⅰ）是一類牙根發(fā)育不良且牙本質(zhì)礦化程度降低的一類常染色體顯性遺傳病，主要特征是牙根短小或缺如，髓腔完全或不完全閉鎖，部分無(wú)齲牙根尖有陰影。目前對(duì)DD-Ⅰ主要集中在患牙超微結(jié)構(gòu)的研究，且主要對(duì)牙本質(zhì)異常進(jìn)行描述，本課題組2010年采集了一個(gè)DD-Ⅰ家系，對(duì)先證者口腔及患牙病理檢查發(fā)現(xiàn)，其患牙牙槽骨高度不足，牙骨質(zhì)變薄。因此，本研究擬通過(guò)體

2、外分離培養(yǎng)DD-Ⅰ家系先證者的牙囊干細(xì)胞(dental follicle stem cells，DFCs)，觀察其生物特性及成骨/成牙骨質(zhì)分化能力，從細(xì)胞生物學(xué)方面為DD-Ⅰ牙根發(fā)育病理機(jī)制尋找新的線索。
　　材料與方法：
　　第一部分 DFCs的體外分離培養(yǎng)及增殖能力的研究
　　1.拔除DD-Ⅰ型家系先證者及健康人根尖發(fā)育未完全的第三磨牙，并采用改良酶消化+組織塊法分離培養(yǎng)DFCs，分別為DD-Ⅰ組和健康對(duì)照組，倒置

3、顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài);
　　2.采用免疫熒光檢測(cè)抗波絲蛋白(VIM)、抗角蛋白(CK)來(lái)鑒定DFCs來(lái)源;
　　3.運(yùn)用有限稀釋法、MTT法檢測(cè)兩組DFCs克隆形成率和生長(zhǎng)曲線;
　　第二部分 DFCs的成骨/成牙骨質(zhì)分化能力的體外探究
　　1.對(duì)兩組DFCs礦化誘導(dǎo)14d、21d、28d后，行茜素紅染色觀察體外礦化結(jié)節(jié)形成情況;
　　2.采用ALP染色（改良Gomori鈣鈷法）檢測(cè)兩組DFCs礦化誘導(dǎo)

4、7d、14d、21d后的堿性磷酸酶活性;
　　3.從mRNA和蛋白水平檢測(cè)礦化相關(guān)蛋白ALP、OCN、BSP、RUNX-2的表達(dá)來(lái)評(píng)估DFCs的成骨/成牙骨質(zhì)能力。
　　結(jié)果：
　　1.倒置顯微鏡下觀察，DFCs為典型的成纖維樣細(xì)胞，呈長(zhǎng)梭形，兩極突起較長(zhǎng)。兩組DFCs形態(tài)相似，但是傳代時(shí)間不同，一般DD-Ⅰ組傳代需要約3-4d，而健康對(duì)照組則傳代需約5-6天。
　　2.免疫熒光顯示:兩組DFCs的Vim(+)，

5、CK(-)，說(shuō)明細(xì)胞來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞;
　　3.細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)顯示:DD-Ⅰ組DFCs克隆形成率約為12.5％，而健康對(duì)照組DFCs克隆形成率為10.5％;
　　4.MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示:兩組DFCs生長(zhǎng)曲線均呈“S”型;與健康對(duì)照組相比，DD-Ⅰ組DFCs從第3天開(kāi)始增殖較快，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;
　　5.礦化誘導(dǎo)14d后行茜素紅染色顯示:兩組DFCs均可見(jiàn)橘紅色鈣化結(jié)節(jié)及黑色鈣鹽成分，但與健

6、康對(duì)照組相比，DD-Ⅰ組DFCs中鈣結(jié)節(jié)數(shù)量少，面積小，鈣鹽成分也減少。
　　6.ALP染色結(jié)果顯示:DD-Ⅰ組和健康對(duì)照組ALP陽(yáng)性細(xì)胞隨著礦化誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)中DD-Ⅰ組陽(yáng)性細(xì)胞量均少于健康對(duì)照組。
　　7.熒光定量PCR結(jié)果顯示:隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間的增加，兩組ALP、OCN、BSP、RUNX-2的表達(dá)逐漸升高;兩組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比，DD-Ⅰ組各基因表達(dá)量均比健康對(duì)照組低，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

7、5)。
　　8.Western blot結(jié)果顯示:ALP、BSP、OCN、RUNX-2在誘導(dǎo)從第7天開(kāi)始，兩組成骨蛋白的表達(dá)量逐漸增加，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比，DD-Ⅰ組各蛋白表達(dá)量均比健康對(duì)照組低，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.采用“酶消化+組織塊法”能成功培養(yǎng)出DD-Ⅰ型患牙的DFCs，且細(xì)胞形態(tài)基本正常，細(xì)胞獨(dú)立生存及增殖能力較強(qiáng);
　　2.DD-Ⅰ型患牙DFCs向成骨/成牙骨質(zhì)分