周期性拉伸應(yīng)力調(diào)節(jié)人椎間盤(pán)軟骨終板干細(xì)胞成骨分化的研究.pdf

1、背景:
　　椎間盤(pán)退行性病變(intervertebral disc degeneration，IDD)是一系列脊柱疾患發(fā)生的前提和病理基礎(chǔ)，在臨床上主要表現(xiàn)為頸腰痛、椎管狹窄、椎間盤(pán)突出、椎體不穩(wěn)等病癥。研究表明，椎間盤(pán)退行性病變所引起頸腰痛在所有到醫(yī)院就診的患者中占第2位，僅次于呼吸道感染感染性疾病。在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，椎間盤(pán)組織的組分、結(jié)構(gòu)及功能都發(fā)生了改變，其中包括髓核組織中蛋白聚糖成分和水分的逐漸丟失，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)排列的紊

2、亂，以及軟骨終板的鈣化及血管化，鄰近椎體骨贅的形成等。然而椎間盤(pán)退變的具體病理生理機(jī)制目前還不清楚。
　　椎間盤(pán)是脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段中最為關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)，并且是較早發(fā)生退行性改變的組織。缺氧、異常應(yīng)力的作用和酸性環(huán)境都與椎間盤(pán)退變密切相關(guān)，其中應(yīng)力扮演了非常重要的角色。大量的研究證實(shí)，異常力學(xué)因素的持續(xù)作用是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的主要原因之一，然而在此過(guò)程中所隱藏的具體病理生理機(jī)制目前還不清楚。
　　在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)人退變軟骨終板中

3、存在類(lèi)似于間充質(zhì)干細(xì)胞樣的細(xì)胞(Cartilage endplate derived stem cells，CESCs)并成功分離出來(lái)。此外我們的團(tuán)隊(duì)在后期的研究中還發(fā)現(xiàn):CESCs具有較強(qiáng)的克隆形成能力以及多向分化潛能。近年來(lái)，應(yīng)力在椎間盤(pán)退變過(guò)程中的作用及相關(guān)機(jī)制被廣泛關(guān)注和研究。本研究旨在前期的研究基礎(chǔ)上，以軟骨終板干細(xì)胞為研究對(duì)象，使用周期性拉伸應(yīng)力裝置FX-4000對(duì)軟骨終板干細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)力加載，初步探討周期性拉伸應(yīng)力對(duì)軟骨終板

4、干細(xì)胞分化的影響。
　　目的:
　　臨床上獲得退變椎間盤(pán)的軟骨終板標(biāo)本，對(duì)所獲得的軟骨終板進(jìn)行消化，原代細(xì)胞貼壁培養(yǎng)、擴(kuò)增后，采用我們既往的方法，應(yīng)用瓊脂糖懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)從第一代細(xì)胞中篩選出軟骨終板干細(xì)胞。通過(guò)觀察應(yīng)力對(duì)軟骨終板干細(xì)胞成骨分化的影響，并初步探討其在椎間盤(pán)退變過(guò)程中的意義，以期為椎間盤(pán)退行性疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法:
　　臨床上獲得退變椎間盤(pán)的軟骨終板標(biāo)本（在腰椎融合手術(shù)中分

5、離），于分離后2小時(shí)之內(nèi)帶入超凈工作臺(tái)。對(duì)獲取的軟骨終板組織在解剖顯微鏡下，使用眼科手術(shù)器械對(duì)獲取組織標(biāo)本進(jìn)行再次清理，清理結(jié)束后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）沖洗后。將洗凈的組織剪切成體積約為1mm×1mm×1mm大小的組織塊，將剪碎組織塊轉(zhuǎn)移入25cm2培養(yǎng)瓶中，加入約5倍體積含0.15％Ⅱ型膠原酶無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基，靜置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜消化。消化完成后，用70μm的細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾消

6、化液，將濾液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的離心管中，1000r/min離心5min。離心結(jié)束后，取出離心管，倒掉上清液。收集細(xì)胞沉淀，加入含有棄上清，加入含有10％FBS、1％雙抗的BMEM/F12的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，倒置相差顯微鏡下觀察軟骨終板細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)90％融合后，利用瓊脂懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)篩選出CESCs進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)。然后對(duì)篩選出來(lái)的細(xì)胞行三系誘導(dǎo)分化鑒定和流式細(xì)胞術(shù)表型分析。<

7、br>　　選取生長(zhǎng)良好的第三代CESCs，接種于BioFlex6孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80-90％融合后，換成FBS體積分?jǐn)?shù)為1％的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，使各組細(xì)胞同步化。在無(wú)誘導(dǎo)因子的作用下，將培養(yǎng)板置于Flexcell-4000TM應(yīng)力加載系統(tǒng)中，施加1h、6h、12h、24h，頻率為1Hz、拉伸率為10％的牽拉刺激，同時(shí)做靜態(tài)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。牽拉完成后，收集細(xì)胞，應(yīng)用Western blot檢測(cè)BMP-2的表達(dá)情

8、況，使用qPCR測(cè)定部分成骨、成軟骨基因的表達(dá)變化
　　結(jié)果:
　　1.將獲得的軟骨終板細(xì)胞進(jìn)行篩選后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及三系誘導(dǎo)分化鑒定提示篩選出來(lái)的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。
　　2.將篩選出來(lái)的CESCs進(jìn)行周期性應(yīng)力加載后，發(fā)現(xiàn)與成骨有關(guān)的基因(BMP-2、ALP、Runx2)的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與成軟骨有關(guān)基因(SOX9)表達(dá)量隨拉伸時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量卻逐漸降低。
　　結(jié)論: