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文檔簡(jiǎn)介
1、背景及目的:腰痛(low back pain,LBP)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛流行,是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要疾病之一。椎間盤(Intervertebral disc,IVD)退變(Intervertebral disc degeneration,IDD)是LBP的一個(gè)重要的特異性致病因素。因此,預(yù)防、延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變被認(rèn)為是一種非常具有臨床應(yīng)用前景的治療LBP的策略。然而,迄今為止,我們對(duì)椎間盤退變發(fā)病機(jī)制的了解還非常有限。最新的研究認(rèn)為
2、:椎間盤退變是一個(gè)由多種危險(xiǎn)因素引起的,椎間盤細(xì)胞所介導(dǎo)的自身結(jié)構(gòu)和功能逐漸破壞的過(guò)程,其發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持系統(tǒng)的破壞。該系統(tǒng)主要由椎間盤內(nèi)的體細(xì)胞和內(nèi)源性干細(xì)胞組成。其中,具有自我更新和多向分化潛能的內(nèi)源性干細(xì)胞被認(rèn)為可以感受椎間盤內(nèi)存活和功能細(xì)胞數(shù)量的減少以及椎間盤的結(jié)構(gòu)損傷,然后遷移至損傷部位并分化為組織特異性細(xì)胞,從而維持椎間盤內(nèi)存活和功能細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定,最終參與維持椎間盤結(jié)構(gòu)與功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此,椎間盤內(nèi)的
3、內(nèi)源性干細(xì)胞的遷移與多向分化能力對(duì)于椎間盤結(jié)構(gòu)和功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在我們的前期研究中,我們?cè)谌塑浌墙K板中發(fā)現(xiàn)了可以成軟骨、成骨和向髓核樣細(xì)胞分力的干細(xì)胞,并命名為軟骨終板干細(xì)胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)。因此,我們推測(cè)CESCs在椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。但是,我們對(duì)于CESCs遷移和分化機(jī)制的了解還非常有限。有證據(jù)表明,趨化因子及其受體是促使干細(xì)胞遷移的一個(gè)重要因素。然
4、而,至今還沒(méi)有研究去探討椎間盤內(nèi)促進(jìn)CESCs遷移的趨化因子及其具體機(jī)制。另一方面,CESCs的分化方向是受到多種椎間盤微環(huán)境因素影響的,退變椎間盤內(nèi)復(fù)雜的生物化學(xué)和物理微環(huán)境又是復(fù)雜而惡劣的。在退變微環(huán)境的影響下,遷移到損傷部位的CESCs是分化為具有“修復(fù)”功能的體細(xì)胞而發(fā)揮內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持作用;還是發(fā)生“負(fù)面轉(zhuǎn)化”而進(jìn)一步破壞椎間盤的內(nèi)穩(wěn)態(tài),這是一個(gè)值得深入探討的問(wèn)題。N-acetylted proline-glycine-prolin
5、e(N-Ac-PGP)是一種由膠原蛋白降解產(chǎn)生的趨化因子,能夠作用于中性粒細(xì)胞表面的CXCR1/2受體來(lái)趨化中性粒細(xì)胞,從而廣泛參與到諸如急性肺部感染、慢性阻塞性肺病、炎性腸病、缺血性腦梗死等炎癥性疾病中。然而,至今還沒(méi)有研究去證明N-Ac-PGP是否存在于退變的椎間盤中,特別是在以膠原蛋白降解為主要病理學(xué)特征的退變髓核組織中。本研究的目的在于通過(guò)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、ELISA和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法明確人退變髓核組織中N-Ac-PGP的存在
6、情況及其產(chǎn)生的分子途徑,并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討N-Ac-PGP對(duì)CESCs遷移和分化的調(diào)控作用。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為進(jìn)一步闡明椎間盤退變的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù),同時(shí),也為進(jìn)一步完善基于干細(xì)胞的椎間盤再生修復(fù)的方法提供了新的理論依據(jù)。
方法:通過(guò)手術(shù)獲取人體髓核組織標(biāo)本,利用免疫組織化學(xué)染色,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析檢測(cè)髓核組織中N-Ac-PGP生成相關(guān)蛋白酶和N-Ac-PGP本身的存在情況和濃度,并通過(guò)相
7、關(guān)性分析明確椎間盤退變程度與髓核組織中N-Ac-PGP濃度的關(guān)系。對(duì)人髓核細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),利用免疫熒光染色確定髓核細(xì)胞是否表達(dá)與N-Ac-PGP生成相關(guān)蛋白酶,并利用N-Ac-PGP的間接體內(nèi)生成實(shí)驗(yàn)明確髓核細(xì)胞是否可以降解膠原蛋白生成N-Ac-PGP。接下來(lái),對(duì)人CESCs進(jìn)行原代培養(yǎng),利用transwell遷移模型,熒光定量PCR,Western blot檢測(cè),免疫熒光染色,F(xiàn)-actin染色以及CXCR1/2的抑制實(shí)驗(yàn)去分析N-
8、Ac-PGP對(duì)CESCs體外遷移的影響及其分子機(jī)制。基于家兔動(dòng)物模型,將N-Ac-PGP以及CXCR1/2拮抗劑注射進(jìn)入家兔腰椎間盤,然后利用H&E染色方法觀察N-Ac-PGP對(duì)軟骨終板內(nèi)細(xì)胞遷移的影響極其受體機(jī)制。另一方面,通過(guò)對(duì)家兔腰椎間盤切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,明確受N-Ac-PGP誘導(dǎo)后向髓核遷移的細(xì)胞中的不同細(xì)胞類型。利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),Western blot檢測(cè),實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CESCs在N-Ac-PGP的作用下向
9、髓核樣細(xì)胞表型和促炎癥表型的分化情況,明確N-Ac-PGP對(duì)CESCs分化的調(diào)控作用。
結(jié)果:
1.人體髓核組織有N-Ac-PGP生成相關(guān)蛋白酶(MMP8,MMP9和PE)的存在。MMP8和MMP9的濃度隨著椎間盤退變程度的加重而升高。
2.人體髓核組織中N-Ac-PGP的濃度與椎間盤的退變程度呈正相關(guān)。
3.人髓核細(xì)胞在體內(nèi)和體外都表達(dá)MMP8,MMP9和PE。髓核細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以降解Ⅱ型膠
10、原蛋白產(chǎn)生N-Ac-PGP,而且這種N-Ac-PGP的生成能力隨著椎間盤退變程度的增加而增加。
4.N-Ac-PGP可以顯著促進(jìn)CESCs的體外遷移。
5.CESCs在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上表達(dá)CXCR1和CXCR2。在N-Ac-PGP的作用下,CXCR1和CXCR2在CESCs中的表達(dá)顯著上調(diào)。
6.CXCR1和CXCR2的拮抗劑可以抑制N-Ac-PGP對(duì)CESCs體外遷移的促進(jìn)作用。
7.N-Ac-
11、PGP促進(jìn)CESCs中F-actin細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的合成與重排,并誘導(dǎo)CESCs偽足的形成,而這種作用可以被CXCR1和CXCR2的拮抗劑所抑制。
8.向家兔腰椎間盤內(nèi)注射N-Ac-PGP可以誘導(dǎo)軟骨終板內(nèi)細(xì)胞向髓核內(nèi)遷移,這種遷移可以被CXCR1和CXCR2拮抗劑所抑制。遷移的細(xì)胞中有表達(dá)MT-MMP1和CD105的軟骨細(xì)胞和表達(dá)MT-MMP1,CD105和Stro-1的梭型細(xì)胞。
9.N-Ac-PGP抑制CESCs
12、向髓核樣表型分化,并誘導(dǎo)CESCs向促炎癥表型分化。N-Ac-PGP的這種調(diào)控分化的作用也可以被CXCR1和CXCR2的拮抗劑所抑制。
結(jié)論:在椎間盤的微環(huán)境中,存在有由髓核細(xì)胞分泌MMP8,MMP9和PE級(jí)聯(lián)分解膠原蛋白而產(chǎn)生的N-Ac-PGP。N-Ac-PGP的濃度與椎間盤退變程度密切相關(guān)。N-Ac-PGP是椎間盤微環(huán)境中的趨化因子,它能夠結(jié)合CESCs的CXCR1和CXCR2來(lái)誘導(dǎo)其向髓核內(nèi)遷移,從而促使CESCs向組織
13、損傷部位遷移。然而,在N-Ac-PGP的作用下,CESCs向髓核樣細(xì)胞的分化被抑制,導(dǎo)致CESCs在損傷部位不能正常發(fā)揮其對(duì)椎間盤結(jié)構(gòu)和功能內(nèi)穩(wěn)態(tài)的促進(jìn)作用。更嚴(yán)重的是,N-Ac-PGP還會(huì)促進(jìn)CESCs向促炎癥表型分化,這些促炎癥細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步加重椎間盤微環(huán)境中的基質(zhì)分解和炎癥反應(yīng),從而加速椎間盤結(jié)構(gòu)和功能內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞,最終加速椎間盤退變的進(jìn)程。抑制N-Ac-PGP的大量生成可能是提高退變椎間盤干細(xì)胞治療的效率并促進(jìn)椎間盤再生的新靶點(diǎn)。
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