Toll樣受體-3和-4對干細胞成軟骨分化的影響及機制.pdf

1、目的:探索Toll樣受體（Toll Like Receptor，TLR）-3和-4在骨髓間充質干細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）成軟骨分化的過程中對蛋白多糖和II型膠原蛋白形成的影響及機制。
　　方法:用Ficoll密度梯度離心法分離SD大鼠BMSCs，并進行傳代擴增。流式細胞術檢測細胞表面標志物CD34、CD44、CD54、CD90的表達進行細胞鑒定。取活力好的第3代BMS

2、Cs作為實驗對象，在正式分組干預前，首先以Western blot法檢測蛋白多糖和II型膠原的表達，作為后續(xù)試驗的比較基線。再將BMSCs隨機分為空白組、TLR-3激活組、TLR-4激活組，分別以PBS、TLR-3激動劑（Poly[I:C]，SIGMA P9582-5MG1μg/ml）、TLR-4激動劑（LPS，SIGMA L2630-10MG1μg/ml）處理后。三組細胞均進行成軟骨誘導分化培養(yǎng)。培養(yǎng)第14天，以阿利新藍染色檢測蛋白多

3、糖的形成，以免疫熒光及Western blot法檢測II型膠原的表達，以實時熒光定量PCR檢測Sox-9的表達。
　　結果:以Ficoll密度梯度離心法成功分離得到成纖維樣貼壁生長的細胞，流式細胞技術檢測表面標志物表達，結果為CD34（—）、CD44（+）、CD54（+）、CD90（+），符合BMSCs表面標志物表達特點，證實分離培養(yǎng)所得細胞為大鼠BMSCs。分組處理前，細胞并不表達蛋白多糖及II型膠原，BMSCs在化學組成上并不

4、表現(xiàn)出成軟骨細胞的特性。經(jīng)過2周成軟骨分化誘導培養(yǎng)，空白組、TLR-3激活組和TLR-4激活組均生成了蛋白多糖，阿利新藍染色均為陽性，計數(shù)并比較發(fā)現(xiàn)，三組間陽性細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（F=0.628， P=0.547>0.05）。免疫熒光及Western-blot結果顯示，三組均表達II型膠原，但空白組表達明顯低于TLR-3激活組和TLR-4激活組（t3=3.993，P3=0.003<0.05；t4=7.650，P4=0.000<0.0

5、5），而后兩組間無明顯差異（t=0.934，P=0.372>0.05）。PCR結果顯示，TLR-3和TLR-4激活組Sox-9相對表達量分別是對照組Sox-9表達量的2.2倍和2.14倍，差異具有統(tǒng)計學意義（t3=4.47，P3=0.00<0.05；t4=3.61， P4=0.02<0.05），而前兩組之間Sox-9的表達量無明顯差異（t=1.12，P=0.27>0.05）。
　　結論:經(jīng)過成軟骨誘導分化培養(yǎng)，大鼠BMSCs能夠形