Toll樣受體TLR2和TLR4的激活對小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的影響.pdf

1、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓基質(zhì)中的非造血成體干細(xì)胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類抗原和共刺激分子，MSCs的這些特性使其被應(yīng)用于多種疾病的臨床治療研究當(dāng)中，如成骨不全，心肌梗塞等。同時(shí)，近年來研究表明MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)功能，其對于同種異基因骨髓移植后的移植物抗宿主病(GVHD)的治療作用受到越來越多的關(guān)注。然而MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制仍然不

2、明確，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用，有研究認(rèn)為細(xì)胞因子、趨化因子和其他炎癥介質(zhì)可能介導(dǎo)MSCs的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類天然免疫模式識別受體，特異性識別病原微生物(如細(xì)菌、病毒、真菌)中的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，例如：TLR2識別革蘭氏陽性菌的脂蛋白、肽聚糖和脂磷壁酸質(zhì)類；TLR3識別病毒的雙鏈RNA；TLR4識別革蘭氏陰性菌的脂多糖、熱休克蛋白和細(xì)胞外基

3、質(zhì)等內(nèi)源性分子。目前已有十余種TLRs被發(fā)現(xiàn)，MSCs上也有功能性TLRs的表達(dá)，研究表明，MSCs上TLRs與內(nèi)源性或外源性TLR配體相結(jié)合后能激活下游信號分子，介導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子(如IL-6、IL-8、CXCL10)的分泌，并影響MSCs的增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。由于MSCs在治療GVHD中的應(yīng)用，移植的MSCs不可避免地會遭遇來自感染、炎癥等“危險(xiǎn)信號”的刺激，因此深入探討TLRs激活對MSC免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的影響具有重要意義

4、。為此，本實(shí)驗(yàn)研究TLR2和TLR4與相應(yīng)配體Pam3cys、LPS結(jié)合被激活后，對小鼠MSCs的遷移、抑制淋巴細(xì)胞增殖以及上調(diào)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例等方面的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。本課題的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括兩部分：
　　 第一部分：C57BL/6小鼠骨髓來源MSCs的體外分離、培養(yǎng)及鑒定(包括表面標(biāo)記和多向分化能力)。
　　 第二部分：通過流式細(xì)胞亞群分析、Transwell遷移試驗(yàn)及單向混

5、合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)研究TLR2和TLR4的激活對小鼠MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響，并進(jìn)一步通過ELISA和熒光定量real-timePCR探討其可能的作用機(jī)制。
　　 第一部分小鼠骨髓MSCs的體外分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 1.方法
　　 取C57BL/6小鼠的股骨，沖洗骨髓腔獲得骨髓細(xì)胞，裂解紅細(xì)胞后用L-DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，借助MSCs的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞接近融合時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳

6、代，逐步獲得形態(tài)均一的mMSCs。對體外培養(yǎng)的mMSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察，利用流式細(xì)胞儀檢測mMSCs表面標(biāo)記，并通過定向誘導(dǎo)mMSCs分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞來對其進(jìn)行鑒定。
　　 2.結(jié)果
　　 細(xì)胞接種后6～10左右天可見有貼壁細(xì)胞，形態(tài)呈短梭形，并逐漸形成細(xì)胞克隆，接近融合后進(jìn)行消化傳代，約8-9周后可獲得形態(tài)均一的mMSCs。流式細(xì)胞儀檢測所獲得的mMSCs上Sca-1、CD44呈陽性表達(dá)，不表達(dá)CD45、CD

7、11b、CD117及MHC-Ⅱ。
　　 在對mMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的10～12天左右光鏡下可見致密團(tuán)塊樣的結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)大小不等，誘導(dǎo)14天進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)節(jié)被染為橘紅色，證實(shí)為鈣結(jié)節(jié)。mMSCs成脂誘導(dǎo)的4～6天左右光鏡下可見細(xì)胞中出現(xiàn)圓形小脂滴，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長小脂滴逐漸聚集成大的脂泡，誘導(dǎo)12天對其進(jìn)行油紅O染色可見脂滴被染成紅色。
　　 3.結(jié)論
　　 從小鼠的骨髓中成功分離、培養(yǎng)出mMSCs，呈短梭

8、形，貼壁生長，具有較強(qiáng)的增殖能力；對得到的mMSCs的表型分析結(jié)果顯示Sca-1、CD44呈陽性表達(dá)，不表達(dá)CD45、CD11b、CD117及MHC-Ⅱ，并證實(shí)其在經(jīng)過誘導(dǎo)后可以向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化，具有多向分化潛能。
　　 第二部分TLR2和TLR4的激活對mMSCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響
　　 1.方法
　　 通過Transwell實(shí)驗(yàn)觀察Pam3cys、LPS(分別為TLR2和TLR4相應(yīng)配體)對mMSCs

9、遷移的影響；通過單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(single-direction allo-mixed lymphocytes reaction，MLR)，探討TLR2和TLR4激活后的對mMSCs調(diào)控淋巴細(xì)胞增殖和CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)產(chǎn)生的影響；ELISA檢測趨化因子CXCL-10的分泌差異，并通過熒光定量PCR檢測CXCL-10、iNOS的表達(dá)，探討TLRs介導(dǎo)mMSCs免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的可能機(jī)制。
　　

10、 2.結(jié)果
　　 2.1TLR2、TLR4相應(yīng)配體對于mMSCs遷移的影響。
　　 Transwell實(shí)驗(yàn)中，TLR2配體Pam3cys可抑制mMSCs的定向遷移，并且這種抑制作用隨著Pam3cys濃度的增加而增加，然而TLR4配體LPS對mMSCs的遷移無明顯影響。
　　 2.2TLR2、TLR4激活對mMSCs調(diào)控MLR和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的產(chǎn)生有不同影響。
　　 在單向混合淋巴細(xì)胞

11、培養(yǎng)體系，TLR2激活可顯著削弱mMSCs對同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制，并抑制Treg細(xì)胞產(chǎn)生(8.83％±1.02vs15.12％±1.02；p＜0.05)；而TLR4激活則對mMSCs調(diào)控同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和Treg細(xì)胞產(chǎn)生無明顯影響。
　　 2.3TLR2、TLR4的激活對CXCL-10的表達(dá)和分泌以及iNOS表達(dá)的影響。
　　 同未處理mMSCs組相比，TLR2激活可顯著降低mMSCsCXCL-10的分泌；而T

12、LR4激活對mMSCsCXCL-10的分泌無明顯影響。定量PCR結(jié)果進(jìn)一步顯示，在混合淋巴細(xì)胞與不同預(yù)處理的mMSCs共培養(yǎng)的各時(shí)間點(diǎn)，同未處理mMSCs或LPS處理mMSCs相比，Pam3cys處理的mMSCs上CXCL-10的表達(dá)均維持在較低水平；而iNOS的表達(dá)則高于未處理mMSCs及LPS處理后mMSCs。
　　 3.結(jié)論
　　 3.1TLR2配體抑制mMSCs的遷移，這種作用呈劑量依賴性，而TLR4配體對mMS

13、Cs的遷移沒有明顯影響。
　　 3.2TLR2的激活削弱了mMSCs對于同種異基因刺激的淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，同時(shí)降低了MLR體系中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，而TLR4的激活無明顯作用。
　　 3.3TLR2的激活降低了趨化因子CXCL-10的表達(dá)和分泌，而TLR4的激活對CXCL-10無明顯影響。TLR2激活后CXCL-10表達(dá)降低而iNOS則高表達(dá)，表明TLRs的激活對mMSCs免疫調(diào)節(jié)作用