TLR4基因轉(zhuǎn)染樹突狀細胞對支氣管哮喘的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景
　　 支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，屬于超敏反應(yīng)性質(zhì)，多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)和細胞因子與其發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中輔助T細胞亞群(Th1/Th2)的失衡、Th2細胞數(shù)量增加、功能活化起著關(guān)鍵作用。樹突狀細胞是目前已知的功能最強的抗原遞呈細胞(APC)，系已知唯一能活化初始T細胞的APC，是識別內(nèi)外源性抗原、調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵因素。已知分布于氣道的DC是呼吸道免疫防御的前哨細胞，在通過胞飲、吞噬或受體介導的內(nèi)吞三

2、種方式攝取吸入性抗原后逐漸成熟，趨化因子、共刺激分子和MHCII類分子表達增加，而FcγRⅡ、FcγRⅠ和FcεRⅠ等表達減少，并于24小時內(nèi)從氣道遷移至縱隔淋巴結(jié)產(chǎn)生初級免疫應(yīng)答，促使初始Th細胞(Th0)向Th1或Th2分化。Tho的活化需DC參與的抗原識別信號和協(xié)同刺激信號，其分化方向受控于抗原刺激后DC分泌的細胞因子，IL-12和IFN-γ是誘導Th0向Th1分化的重要細胞因子。許多試驗顯示DC的免疫調(diào)節(jié)作用與其細胞膜表面TLR

3、的表達有關(guān)，一般認為相應(yīng)PAMP通過TLR4激活DC主要引起IL-12p70、IFNγ介導蛋白(IP-10)等細胞因子大量增加。鑒于樹突狀細胞TLR4對于T細胞分化的調(diào)節(jié)作用，若將TLR4基因通過腺病毒載體導入抗原（如LPS）激發(fā)的DC，可促使DC分泌較多的IFN-γ等，上調(diào)Th0表達的IL-12Rβ2和TLR4，從而利于Th0向Th1分化。
　　 目的
　　 將轉(zhuǎn)染了TLR4基因和LPS致敏的DC輸入OVA誘導的過敏性

4、哮喘模型小鼠體內(nèi)，以促進Th1的分化，逆轉(zhuǎn)過敏性哮喘的Th亞群失衡，從而通過TLR4基因轉(zhuǎn)移DC干預(yù)的免疫調(diào)節(jié)方式探討哮喘基因治療的新方法。
　　 方法
　　 1,利用RT-PCR方法，從Balb/c小鼠脾組織細胞mRNA中擴增TLR4基因全長cDNA，并將其連接到pcDNA3.1(+)載體上，進行測序和核酸分析。
　　 2.采用AdMax包裝系統(tǒng)，將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝

5、質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞，利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實現(xiàn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒。RT-PCR方法檢測AdV-TLR4mRNA在傳代DC中的表達、Western Blot方法檢測AdV-TLR4蛋白的表達。
　　 3.RT-PCR方法檢測AdV-TLR4轉(zhuǎn)染的DCIL-12mRNA、IL-4mRNA和IFNγmRNA表達的變化；ELISA方法檢測AdV-TLR4轉(zhuǎn)染的DC培養(yǎng)上清IL-12、IL-4和IFN-γ的表達水平；流式細胞儀

6、分析AdV-TLR4轉(zhuǎn)染的DC表面免疫特性標志蛋白Ia、CD40、CD80和CD86的改變。
　　 4.0.1％0VAAl(OH)3溶液皮下注射、1％OVA的生理鹽水溶液霧化吸入的方法制備小鼠哮喘模型；福爾馬林組織固定、包埋、切片，HE染色和AB/PAS復染進行小鼠肺組織學形態(tài)觀察，Gimsa-Wright染色觀察BALF中Eos;骨髓細胞分離，紅細胞裂解液處理，GM-CSF和IL-4誘導、RMPI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的方式獲

7、取DC，行哮喘小鼠DCTLR4mRNA和TLR4蛋白表達檢測；ELISA方法檢測小鼠脾細胞IL-4、IL-5、IFN-γ和血漿IgE含量、人血漿IL-4和IgE含量、BALF中IL-4和IgE含量；流式細胞儀方法檢測脾細胞CD4+CD25+細胞百分比。
　　 結(jié)果
　　 1.擴增得到的小鼠TLR4基因cDNA全長2508bp，編碼536個氨基酸，blast結(jié)果分析表明，該cDNA與Genbank中發(fā)表的序列(NM0212

8、97)具有100％的同源性。
　　 2.重組質(zhì)粒pDC316-mTLR4的PCR及酶切鑒定表明，TLR4基因被定向插入；與pBHGF35骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞并包裝成病毒，經(jīng)病毒DNA的PCR檢測，證實已完成對重組病毒的包裝；重組病毒轉(zhuǎn)染小鼠DC，其TLR4mRNA和TLR4蛋白均明顯表達。
　　 3.誘導Th1細胞分化的IL-12、IFN-γ在Ad-TLR4轉(zhuǎn)染DC后48小時表達量明顯增高，而誘導Th2細胞分化的IL

9、-4表達量明顯降低；轉(zhuǎn)染細胞的PCR檢測顯示IL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA的變化與相應(yīng)蛋白表達量的變化具有一致性；LPS實驗進一步證實顯示，LPS對轉(zhuǎn)染細胞表達細胞因子的影響與LPS有關(guān)，LPS(+)轉(zhuǎn)染DC組上述細胞因子改變的幅度高于LPS（-）組，LPS具有促進和加強Ad-TLR4-DC的某些生物學特性的改變。流式細胞檢測表明Ad5F35-mTLR4組DC細胞CD86表達較對照組和Ad5F35-mCMV-E

10、GFP明顯增高；進一步的實驗顯示，Ad5F35-mTLR4轉(zhuǎn)染DC LPS(+)組Ia、CD40和CD80表達較相應(yīng)LPS（-）明顯增高；LPS(+)對照組CD80和CD86表達也較相應(yīng)LPS（-）組明顯增高。LPS具有促進和加強Ad-TLR4-DC細胞表面某些免疫特性標志蛋白的改變。
　　 4.TLR4 DC懸液給予過敏性哮喘模型小鼠，顯示表現(xiàn)為杯狀細胞增生減少、氣道內(nèi)粘液減少，WBC數(shù)、Eso比率和IL-4水平均降低，而免疫

11、調(diào)節(jié)性T細胞CD4+CD25+細胞百分率增高，顯示TLR4 DC具有明顯的抗支氣管哮喘作用。TLR4 DC抗支氣管哮喘的機制，推測與TLR4 DC激發(fā)使具有調(diào)節(jié)T細胞分化的細胞因子改變有關(guān)，如IFN-γ增加可促使Th1分化；TLR4DC進入機體還促使了免疫調(diào)節(jié)性T細胞CD4+CD25+增加，免疫調(diào)節(jié)性T細CD4+CD25+可增加機體對過敏物質(zhì)的耐受性，進而可減輕其炎癥反應(yīng)。
　　 結(jié)論
　　 1.成功構(gòu)建了小鼠TLR4基

12、因的全長編碼區(qū)cDNA。
　　 2.重組病毒感染滴度為2.3×108IU/ml，可用于體內(nèi)外動物實驗。在本研究中作為TLR4基因干預(yù)對機體Th1/Th2平衡影響的研究工具。
　　 3.LPS促進Ad-TLR4-DC細胞表面Ia、CD40、CD80和CD86免疫特性標志蛋白改變，促進DCIL-12、IL-4和IFN-γ表達改變，推測這些改變與DCTLR4信號傳導有關(guān)。
　　 4.TLR4 DC對OVA誘導的支氣管炎