轉(zhuǎn)錄因子RORα對(duì)支氣管哮喘的免疫調(diào)控作用.pdf

1、背景：支氣管哮喘是一類(lèi)由多種免疫細(xì)胞參與的慢性炎癥性氣道疾病，可發(fā)生于任何年齡。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘患者體內(nèi)存在著一群非T非B的免疫細(xì)胞，即固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cells，ILCs)。此類(lèi)細(xì)胞不表達(dá)任何譜系的標(biāo)志，但是其具備類(lèi)似T淋巴細(xì)胞的功能。根據(jù)與此類(lèi)細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、表面表達(dá)的受體以及其活化后分泌的特征性細(xì)胞因子，可將ILCs分為三類(lèi)，包括ILC1s、ILC2s和ILC3s。在健康個(gè)體

2、體內(nèi)，ILCs的量微乎其微，而在病理狀態(tài)下可被活化而比例增加。支氣管哮喘發(fā)作時(shí)，活化的ILC2s分泌IL-13、IL-5等細(xì)胞因子，維持Th2極化狀態(tài)，參與免疫損傷。在這些促炎細(xì)胞因子的作用下，使氣道局部呈現(xiàn)氣道高反應(yīng)性，形成典型的哮喘癥狀。
　　RORα，是維甲酸相關(guān)的孤核受體家族的成員之一，其在各種生物體的多種組織均有表達(dá)。作為ILC2s的特征性轉(zhuǎn)錄因子，RORα在ILC2s分化增殖過(guò)程中以及功能的發(fā)揮方面發(fā)揮重要作用。目前的

3、研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠缺失RORα?xí)r，其體內(nèi)ILC2s的數(shù)量減少，并且對(duì)于寄生蟲(chóng)的免疫能力減弱。而缺乏ILC2s的小鼠經(jīng)過(guò)繼轉(zhuǎn)移ILC2s，則小鼠的ILC2s功能可獲重建。
　　目的：為了探討RORα于支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床哮喘病的治療尋找新的途徑。本研究在建立哮喘小鼠模型的基礎(chǔ)上，分析ILC2s在模型鼠的分布，并經(jīng)構(gòu)建RORα表達(dá)載體研究其對(duì)ILC2s的調(diào)控作用，探討用于干預(yù)哮喘模型鼠的可能性。旨在為RORα的應(yīng)用研究奠定

4、理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料與方法
　　(1)臨床病例分析:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)支氣管哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中ILC2s的比例;RT-qPCR方法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中RORα、T-bet、GATA3、IL-33、IL-25、IL-13、IL-5、IL-4的mRNA表達(dá)水平;ELISA法測(cè)定血清中的IL-33、IL-13、IL-5的蛋白含量;直線回歸法分析RORα的mRNA表達(dá)水平與ILC2s活性的相關(guān)性、RORα的mRNA表

5、達(dá)水平與Th1、Th2細(xì)胞相關(guān)分子的相關(guān)性、ILC2s的特征性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平與Th2細(xì)胞特征性細(xì)胞因子的相關(guān)性。
　　(2)小鼠哮喘模型的誘導(dǎo)和RORα表達(dá)載體的體內(nèi)干預(yù)試驗(yàn):
　　1)構(gòu)建RORα表達(dá)載體:無(wú)菌分離小鼠脾臟組織，運(yùn)用RT-PCR從小鼠脾臟組織的mRNA中克隆出mRORα全長(zhǎng)編碼區(qū)的cDNA，并將該cDNA連接到PMD-18T載體，同時(shí)鑒定該載體序列。再定向克隆入腺病毒的穿梭載體pDC316-mCM

6、V-EGFP，并與骨架載體PBHGloxdetalE1，3Cre一同于HEK293內(nèi)包裝，并純化腺病毒。
　　2)小鼠哮喘模型的誘導(dǎo)及RORα表達(dá)載體的干預(yù):建立OVA誘導(dǎo)的支氣管哮喘模型。利用Ad-RORα干預(yù)后。運(yùn)用H&E染色的方法觀察肺組織病理學(xué)的變化;流式細(xì)胞儀分析模型鼠外周血ILC2s細(xì)胞比例;用細(xì)胞計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)BALF中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況;ELISA檢測(cè)血清IL-33、IL-13、IL-5等細(xì)胞因子的含量;肺組織和支氣管

7、肺泡灌洗液中RORα、IL-33、IL-13、IL-5、IL-4和GATA3等mRNA表達(dá)水平用RT-qPCR法測(cè)定、肺組織中RORα、ST2蛋白的表達(dá)以Western-blot法檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　(1)支氣管哮喘患者外周血中ILC2s的比例相對(duì)于正常對(duì)照者明顯升高，且血清IL-33以及ILC2s的特征性細(xì)胞因子IL-13、IL-5的蛋白含量也隨之升高;同時(shí)，外周血單個(gè)核細(xì)胞中RORα、IL-33、IL-13、IL-5

8、、IL-4、GATA3的mRNA表達(dá)水平也呈升高趨勢(shì)，而Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA則呈降低趨勢(shì)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RORα與ILC2s呈正相關(guān)，IL-33亦與ILC2s的特征性細(xì)胞因子IL-13、IL-5、IL-4呈正相關(guān)。
　　(2)成功克隆了小鼠RORα基因的全長(zhǎng)序列，經(jīng)測(cè)序無(wú)誤。經(jīng)定向克隆的方法，成功將RORα的全長(zhǎng)基因克隆入pDC316-mCMV-EGFP，經(jīng)過(guò)PCR、酶切分析和測(cè)序鑒定均無(wú)誤。
　　

9、(3)腺病毒的包裝:成功大量制備了攜帶小鼠RORα的穿梭載體pDC316-RORα-mCMV-EGFP、骨架載體PBHGloxdetalE1，3Cre，隨后將穿梭載體pDC316-RORα-mCMV-EGFP與骨架載體PBHGloxdetalE1，3Cre一同轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞，經(jīng)過(guò)純化后，成功地包裝出了高滴度的攜帶小鼠RORα的腺病毒。
　　(4)小鼠哮喘模型的建立:用OVA成功誘導(dǎo)小鼠哮喘動(dòng)物模型，經(jīng)模型鼠肺組織H

10、&E染色鏡檢，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與OVA組和OVA+Ad-EGFP組相比，Ad-RORα處理的模型鼠，其肺組織中的炎癥細(xì)胞增多更為明顯，且哮喘癥狀更為明顯，出現(xiàn)強(qiáng)烈地抓耳撓腮、抬起前肢、大小便失禁、呼吸急促等哮喘表現(xiàn)。同時(shí)，處理組小鼠與未處理的OVA誘模組和Ad-EGFP處理組相比，其支氣管肺泡灌洗液中IgE的水平明顯增加。
　　(5)哮喘模型中ILC2s相關(guān)的因子檢測(cè):Ad-RORα處理組循環(huán)ILC2s明顯高于未處理的模型鼠

11、和Ad-EGFP對(duì)照組，提示ILC2s參與的哮喘的發(fā)病過(guò)程，而轉(zhuǎn)錄因子RORα發(fā)揮了推波助瀾的作用。此外，在Ad-RORα處理組，促進(jìn)ILC2s活化的IL-33，ILC2s的特征性細(xì)胞因子IL-13、IL-5和轉(zhuǎn)錄因子GATA3，以及Th2細(xì)胞因子IL-4等均明顯升高。同時(shí)，我們亦發(fā)現(xiàn)IL-33蛋白升高，升高的IL-33進(jìn)一步促進(jìn)ILC2s的增殖活化。
　　結(jié)論：哮喘患者機(jī)體ILC2s數(shù)量及其相關(guān)分子表達(dá)增加，與此同時(shí)，上調(diào)的RO