重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的抑制轉(zhuǎn)錄因子ROG對(duì)支氣管哮喘的防治作用研究.pdf

1、目的 1.建立可長(zhǎng)期培養(yǎng)的抗原特異性的Th1/Th2克隆及細(xì)胞系。 2.克隆小鼠ROG基因，構(gòu)建表達(dá)ROG的重組腺相關(guān)病毒載體pAAV-ROG，制備表達(dá)ROG的重組腺相關(guān)病毒rAAV-ROG，研究rAAV-ROG對(duì)哮喘的保護(hù)作用。 方法 用卵蛋白(OVA)免疫Balb/c小鼠，10-14d后取淋巴結(jié)細(xì)胞在體外用同系脾細(xì)胞和OVA反復(fù)刺激，然后分別用IL-2、IFNγ及IL-2、IL-4共同培養(yǎng)，并同時(shí)加入

2、同系脾細(xì)胞和OVA，進(jìn)行Th1和Th2克隆的誘導(dǎo)，并通過有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。對(duì)克隆化的細(xì)胞用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)其分泌細(xì)胞因子的特性。 設(shè)計(jì)、合成引物，通過RT-PCR法從CTLL-2細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增ROG基因，測(cè)序成功后，最終連接于pAAV-MCS，雙酶切、PCR鑒定陽性重組質(zhì)粒，并在Hela細(xì)胞中表達(dá)，測(cè)序鑒定其正確性；大量制備pAAV-ROG、pAAV-RC、pHelper、pAAV-LacZ質(zhì)粒，并調(diào)整質(zhì)粒濃度

3、到1μg/μl。應(yīng)用DMEM高糖培養(yǎng)基，AAV-293細(xì)胞超過50％傳代；培養(yǎng)AAV-293細(xì)胞使之達(dá)到70-80％融合用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法采用磷酸鈣法，分六組，A組：不加DNA；B組：pAAV-ROG、pAAV-RC、pHelper各10μg共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞。C組和D組：分別取pAAV-rhGFP和pAAV-LacZ取代pAAV-ROG，與pAAV-RC、pHelper為對(duì)照。E組和F組：分別為不加pAAV-RC、pHelper

4、，其它操作均同B。鏡下觀察病毒顆粒的產(chǎn)生及培養(yǎng)基的變化。轉(zhuǎn)染后6小時(shí)換新鮮培養(yǎng)基，72h收集細(xì)胞及培養(yǎng)基置于離心管中，將離心管交替置于干冰及37℃水浴中各10分鐘，交替4次后室溫離心，取上清-80℃凍存。進(jìn)一步濃縮采用無水乙醇法。用Hela細(xì)胞通過測(cè)定對(duì)照rAAV-LacZ的病毒滴度間接確定rAAV-ROG、rAAV-rhGFP的滴度。 制備小鼠支氣管哮喘模型：應(yīng)用卵蛋白，動(dòng)物用Balb/c鼠，雌性，體重25-30mg，隨機(jī)分為

5、3組，A組：以PBS代替OVA激發(fā)與致敏；B組和C組均用OVA致敏和激發(fā)，但B組用重組腺相關(guān)病毒處理；C組以PBS處理。按初免劑量10μg/次/鼠(時(shí)間1d、8d、15d)，激發(fā)劑量10μg/次/鼠(時(shí)間26d、27d、28d)的方案制備小鼠支氣管哮喘模型。B組在初免的第2周經(jīng)鼻滴入50μL重組腺相關(guān)病毒溶液，C組予以相同體積的PBS溶液；于29d分批對(duì)小鼠進(jìn)行肺泡灌洗，研究肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)的變化；同時(shí)肺組織行HE染色和免疫組化檢查。

6、各組數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料均數(shù)的t檢驗(yàn)。以p＜0.05為差異顯著。 結(jié)果 共獲得了5個(gè)Th1/Th2細(xì)胞克隆，它們分泌不同的細(xì)胞因子；H-2d限制性分析表明這些T細(xì)胞僅在以Balb/c小鼠的脾細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞時(shí)才對(duì)OVA產(chǎn)生應(yīng)答；不同抗原刺激表明，所獲得的T細(xì)胞僅對(duì)OVA產(chǎn)生特異性應(yīng)答，而其它抗原刺激后增殖反應(yīng)不明顯；ELISPOT分析表明，加入不同誘導(dǎo)因素的克隆分別表達(dá)較高水平的IFNγ和IL

7、-4。 成功擴(kuò)增了小鼠ROG基因，經(jīng)測(cè)序證明其與Genebank上的序列一致；構(gòu)建可表達(dá)ROG基因的重組腺相關(guān)病毒載體pAAV-ROG。轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞3天后，100×普通光學(xué)顯微鏡下可見A組細(xì)胞貼壁完整，培養(yǎng)液呈紅色；B組細(xì)胞變圓，并懸浮，培養(yǎng)液的顏色呈橘黃色；C、D組細(xì)胞同B組；C組在熒光顯微鏡下可見到綠色熒光表達(dá)；E、F組細(xì)胞表現(xiàn)與A組相似。獲得純化病毒的滴度為2×1011/ml。用卵蛋白復(fù)制小鼠支氣管哮喘模型；應(yīng)用