TLR2、TLR4和TLR9在小鼠抵抗鼠傷寒沙門氏菌感染中的作用.pdf

1、研究目的:
　　 傷寒沙門氏菌是一種革蘭氏陰性的腸道桿菌，其感染造成的沙門氏菌疾病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一。人類感染傷寒沙門氏菌主要引起胃腸道炎癥，但肝臟作為一種重要的病原體累積器官，其在機(jī)體清除傷寒沙門氏菌以及傷寒沙門氏菌的體內(nèi)復(fù)制繁殖的博弈過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。
　　 TLR作為一種重要的模式識別受體，能夠識別保守的微生物結(jié)構(gòu)，并激活下游信號通路，引起機(jī)體免疫應(yīng)答。TLR在抵抗微生物感染過程中

2、發(fā)揮了重要的作用。但是，目前亦有文獻(xiàn)證實(shí)病原微生物可以利用TLR介導(dǎo)的相關(guān)機(jī)制逃逸免疫系統(tǒng)的清除作用。因此，不同的TLRs在微生物感染過程中發(fā)揮的異同作用逐漸成為了目前免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)。本研究采用灌胃鼠傷寒沙門氏菌的方式，首先成功建立TLR2-/、TLR4-/-或TLR9-/-小鼠傷寒感染模型;繼而觀察這三種TLRs缺失對鼠傷寒沙門氏菌引起沙門氏菌肝炎程度的影響;最后以巨噬細(xì)胞為核心，深入探究TLRs在誘導(dǎo)沙門氏菌肝炎過程中的作用機(jī)制。

3、
　　 方法:
　　 首先，我們采用灌胃染菌的方法建立了小鼠感染鼠傷寒沙門氏菌的動物模型;感染后傷寒沙門氏菌后，我們記錄并觀察了野生型、TLR2-/-、TLR4-/-以及TLR9-/-小鼠的生存期;并采用CBA方法檢測了小鼠感染傷寒前后血清中的細(xì)胞因子表達(dá)譜的變化。
　　 其次，我們觀察到四種小鼠肝臟腫大的差異。我們采用HE染色的方法分析了傷寒感染小鼠肝臟組織淋巴細(xì)胞浸潤和炎性肉芽腫的情況;檢測傷寒感染小鼠肝臟內(nèi)

4、傷寒菌的負(fù)載量和ALT水平以確定其肝臟損傷情況;并用CBA法分析傷寒感染小鼠肝臟研磨液中的細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　 最后，我們檢測TLR2、TLR4和TLR9缺失巨噬細(xì)胞清除傷寒菌的能力，從而確定這三種TLRs受體對巨噬細(xì)胞功能的影響;流式細(xì)胞術(shù)分別檢測傷寒菌感染后巨噬細(xì)胞表面NK細(xì)胞殺傷性配體的影響，探究了三種TLR的缺失誘導(dǎo)小鼠沙門氏菌肝炎的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠模型的建立<

5、br>　　 我們利用PCR的方法，成功鑒定了TLR2，TLR4和TLR9缺失小鼠種鼠的基因型;并建立了鼠傷寒沙門氏菌數(shù)量與其吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線以確立傷寒菌的絕對數(shù)量;最終我們通過灌胃染菌的方法成功建立了經(jīng)口感染的鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠模型。
　　 2.TLRs在鼠傷寒沙門氏菌感染過程中發(fā)揮不同的作用。
　　 分析四種小鼠感染傷寒菌后的生存期，我們發(fā)現(xiàn)TLR2-/-小鼠對傷寒菌感染相對耐受，而TLR9-/-小鼠則表現(xiàn)出極度

6、敏感;對其全身炎癥的研究發(fā)現(xiàn)，TLR9-/-感染小鼠體內(nèi)存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而TLR2-/-感染小鼠體內(nèi)炎癥則較弱。
　　 3.WT、TLR2-/-、TLR4-/-和TLR9-/-傷寒感染小鼠表現(xiàn)出不同程度的肝臟病理變化。
　　 對小鼠感染沙門氏菌后肝臟病理研究發(fā)現(xiàn)，TLR9-/-小鼠肝臟損傷程度明顯強(qiáng)于野生型小鼠，而TLR2-/-小鼠的肝臟損傷程度弱于野生型小鼠，TLR4-/-小鼠與野生型小鼠無明顯差異，四種小鼠的肝臟

7、病理損傷程度其生存期基本一致。
　　 4.TLR2、TLR4或TLR9缺失影響巨噬細(xì)胞對鼠傷寒沙門氏菌的清除作用。
　　 感染傷寒菌后，巨噬細(xì)胞內(nèi)的iNOS和ROS均明顯升高，但TLR2缺失的巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS水平明顯高于野生型巨噬細(xì)胞而TLR4缺失的巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS水平低于野生型小鼠;TLR9缺失的巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯低于其它三種巨噬細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。胞內(nèi)的iNOS和ROS水平最終影響了巨噬細(xì)胞對傷寒菌的清除能

8、力。
　　 5.TLR2、TLR4或TLR9的缺失影響了傷寒菌感染過程中肝臟NK細(xì)胞的活化
　　 對肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，傷寒感染引起小鼠引起肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞分群發(fā)現(xiàn)顯著變化，NKT細(xì)胞比例減少，NK細(xì)胞比例增加，其中TLR2、TLR4或TLR9的缺失均可以影響了NK細(xì)胞的活化及殺傷功能。
　　 6.TLR2、TLR4或TLR9的缺失影響了傷寒菌感染巨噬細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷的敏感性
　　 對吞噬了傷

9、寒菌的巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞缺失TLR2、TLR4和TLR9后，NK細(xì)胞對其的殺傷功能明顯降低。
　　 7.TLR2、TLR4和TLR9影響RAE-1的表達(dá)水平
　　 對上述現(xiàn)象的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，傷寒感染可以刺激巨噬細(xì)胞表面NK細(xì)胞殺傷活化性配體RAE-1表達(dá)升高，殺傷抑制性配體Qa-1b表達(dá)降低，而TLR2、TLR4和TLR9的缺失均影響了巨噬細(xì)胞表面RAE-1的表達(dá)水平，繼而影響了NK細(xì)胞對其的

10、殺傷功能。
　　 結(jié)論:
　　 1.沙門氏菌肝炎的程度影響了小鼠感染鼠傷寒沙門氏菌后的生存期。
　　 2.肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞在抵抗鼠傷寒沙門氏菌感染過程中發(fā)揮了重要作用，TLR2缺失增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對鼠傷寒沙門氏菌的清除能力，而TLR9的缺失降低了巨噬細(xì)胞對鼠傷寒沙門氏菌的清除能力，TLR4的缺失對巨噬細(xì)胞清除鼠傷寒沙門氏菌的能力影響不明顯。
　　 3.TLR2、TLR4和TLR9缺失均可影響NK細(xì)胞對感染傷寒