TLR2、TLR4、TLR9基因多態(tài)性與艾滋病患者馬爾尼菲青霉菌易感性的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　馬爾尼菲青霉菌病(PenicilliosisMameffei,PSM)是由馬爾尼菲青霉菌(PenicilliumMarneffei,PM)感染引起的機(jī)會(huì)性真菌性疾病，多見(jiàn)于艾滋?。ˋcquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）以及其他原因引起免疫力低下的患者。近年來(lái)，隨著AIDS發(fā)病率的上升，播散性PSM的發(fā)病率也逐年上升。而且，由于該病缺乏特征性臨床表現(xiàn)，病原培養(yǎng)需5~14天，導(dǎo)致早

2、期診斷較為困難，病死率高達(dá)10~20％。CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映AIDS患者免疫系統(tǒng)損害狀況最明確的指標(biāo)，當(dāng)CD4+計(jì)數(shù)小于100cells/ul，AIDS患者容易罹患播散性PSM。然而，臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，在同一地區(qū)同一季節(jié)，年齡、性別、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等情況相仿的AIDS患者，有些感染PM發(fā)病，另一些卻始終都不感染PM，這提示宿主的遺傳因素可能在其中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，宿主的模式識(shí)別受體（Patternrecogn

3、itionreceptors,PRRs）基因多態(tài)性與其罹患侵襲性真菌感染（Invasivefungalinfections，IFIs）緊密相關(guān)。Toll樣受體(Tolllikereceptor,TLR)是PRRs至關(guān)重要部分，可以識(shí)別病原相關(guān)分子模式（Pathogenassociatedmolecularpattern,PAMPs），激活一系列炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗真菌天然免疫作用。其中，TLR成員TLR2、TLR4及TLR9等的單核苷酸多態(tài)

4、性（Singlenucleotidepolymorphisms,SNPs），被證實(shí)與宿主感染多種致病真菌，例如：白色念珠菌，曲霉菌的易感性相關(guān)，但與AIDS患者罹患PM感染的關(guān)系知之甚少。本研究針對(duì)中國(guó)漢族人群，了解AIDS患者TLR2、TLR4及TLR9基因的SNPs，探討上述TLR的基因多態(tài)性與AIDS患者感染PM易感性的關(guān)系，為進(jìn)一步從宿主遺傳水平闡釋宿主與PM的相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1.了解中國(guó)漢族

5、人群AIDS患者TLR2、TLR4及TLR9基因的SNPs。
　　2.探討TLR2、TLR4及TLR9基因多態(tài)性與AIDS患者感染PM易感性的關(guān)系，旨于發(fā)現(xiàn)我國(guó)AIDS人群TLR的PM易感基因型及其單體型。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象：
　　所有研究對(duì)象均為在廣東居住超過(guò)一年的中國(guó)漢族人，年齡19~80歲。病例組為2008-2015年間廣州市第八人民醫(yī)院（簡(jiǎn)稱：八院）診治的AIDS合并PSM患者200例（PSM

6、組），所有患者均經(jīng)病原學(xué)和/或病理學(xué)確診PM感染；對(duì)照組為同時(shí)間段八院收治的無(wú)PSM及其他IFIs的AIDS患者200例（Non-PSM組），與PSM組在性別、年齡以及CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)水平方面1:1匹配。同時(shí)，以76例健康體檢者（健康組）作為健康對(duì)照。PSM組患者根據(jù)其病情嚴(yán)重程度，分為典型PSM組和重型PSM組。本研究已獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和受試者知情同意。
　　2.TLR2、TLR4及TLR9基因與PM易感性相關(guān)SNP

7、s位點(diǎn)的篩選：
　　隨機(jī)篩選PSM組20例及Non-PSM組20例。PSM組男性18例，女性2例。采用一代直接測(cè)序方法，檢測(cè)TLR2、TLR4及TLR9基因編碼區(qū)（Codingsequence，CDS），應(yīng)用matlab軟件分析兩組之間等位基因頻率的差異，篩選可能與PM易感性相關(guān)的SNPs位點(diǎn)。同時(shí)，應(yīng)用生物信息學(xué)分析，尋找既往文獻(xiàn)報(bào)道的TLR2、TLR4及TLR9與感染性疾病易感性相關(guān)的SNP位點(diǎn)。將上述兩種方法獲得的SNP位點(diǎn)

8、作為大樣本驗(yàn)證的備選位點(diǎn)。
　　3.TLR2、TLR4及TLR9基因備選SNPs位點(diǎn)的大樣本檢測(cè)：
　　利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，檢測(cè)200例PSM組、200例Non-PSM組及76例健康組備選SNPs位點(diǎn)的基因型及其頻率。使用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（Hardy-WeinbergEquilibrium，HWE）檢驗(yàn)基因型頻率是否達(dá)到遺傳平衡。
　　4.TLR2、TLR4及TLR9基因SNPs與AIDS患者

9、PM易感性的相關(guān)性分析
　　所有資料均通過(guò)MicresoftExcel軟件錄入，應(yīng)用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用plink軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析及單體型分析。采用以卡方檢驗(yàn)或Fishers精確檢驗(yàn)，對(duì)各組的性別、年齡、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、合并機(jī)會(huì)性感染或其他感染以及各基因型和等位基因頻率的分布進(jìn)行分析；對(duì)于多個(gè)樣本率的多重比較采用Bonferroni法對(duì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行校正，即將原來(lái)設(shè)定的檢驗(yàn)水準(zhǔn)除以檢驗(yàn)次數(shù)，得

10、到實(shí)際用于確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.PSM組患者臨床特點(diǎn)分析：
　　200例AIDS合并PSM患者中，男性160例，女性40例，平均年齡（37.8±9.9）歲。臨床表現(xiàn)主要包括：發(fā)熱（98.0%）、咳嗽（76.0%）、咳痰（65.0%）、氣促（31.0%）、納差（66.0%）、體重下降（57.5%）、貧血（96.0%）、皮疹（53.0%）、肝大（57.0%）、脾大（64

11、.5%）、淋巴結(jié)腫大（31.0%）等。肺部CT異常者105例（52.5%），平均CD4+T淋巴細(xì)胞（17.0±17.4）cells/ul。188例（94%）治愈或好轉(zhuǎn)出院，6例未愈自動(dòng)出院，6例死亡。根據(jù)病情程度分型：134例典型PSM，66例重型PSM。
　　2.PSM組、Non-PSM組及健康組一般臨床資料的比較：
　　Non-PSM200例，其中男性163例，女性37例，患者中位年齡39.5歲（19～77歲），患者CD

12、4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)為0～84cells/ul，平均為（20.2±17.3）cells/ul；健康組76例，其中男53例，女23例，中位年齡38.6歲（21～78歲）。三組研究對(duì)象的性別與年齡構(gòu)成無(wú)明顯差異（χ2=4.486，P=0.11；χ2=2.591，P=0.63）。PSM組與對(duì)照組患者的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)相仿，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.046，P=0.83)。典型PSM組與其匹配的Non-PSM患者，在性別比例、年齡及CD4+淋

13、巴細(xì)胞計(jì)數(shù)方面均無(wú)明顯差異（χ2=0.240，P=0.62；χ2=0.217，P=0.90；χ2=0.052，P=0.82）；重型PSM組與其匹配的Non-PSM患者，在性別比例、年齡及CD4+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)方面也無(wú)明顯差異（χ2=0，P=1；χ2=3.415，P=0.07；χ2=0.341，P=0.56）。
　　3.TLR2、TLR4及TLR9基因與PM易感性相關(guān)SNPs位點(diǎn)的篩選結(jié)果：
　　通過(guò)小樣本DNA測(cè)序，在TLR2

14、、TLR4、TLR9CDS區(qū)共發(fā)現(xiàn)有意義的5個(gè)變異位點(diǎn)：TLR2chr4:154624656，TLR4chr9:120476274，TLR4chr9:120475826，TLR4chr9:120476612，以及TLR4chr9:120475697，其等位基因頻率在PSM組與Non-PSM組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均<0.05）。同時(shí)，又從既往文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)23個(gè)可能與感染性疾病易感性相關(guān)的SNP位點(diǎn)（不與小樣本DNA測(cè)序篩選獲得

15、的位點(diǎn)重復(fù)）：TLR2有9個(gè)，TLR4有12個(gè)，TLR9有2個(gè)。共獲得28個(gè)可能與AIDS患者PM易感性相關(guān)的備選SNP位點(diǎn)。
　　4.TLR2、TLR4及TLR9基因備選SNPs位點(diǎn)大樣本檢測(cè)結(jié)果：
　　所有備選SNP位點(diǎn)都獲得成功測(cè)序，在PSM組、Non-PSM組及健康組中，除TLR4(rs10116253、rs7037117)不符合HWE平衡定律(P<0.05)外，其余位點(diǎn)均符合HWE平衡定律（P>0.05）。

16、　　5.TLR2、TLR4及TLR9基因SNPs與AIDS患者PM易感性的相關(guān)性：
　　28個(gè)備選SNP位點(diǎn)中，共發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)可能與AIDS患者PM易感性相關(guān)：⑴TLR2rs1339的基因型頻率與等位基因頻率：PSM組、Non-PSM組及健康組三組間比較及重型PSM組與其對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≥0.05），但典型PSM組與其對(duì)照組比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.761，P=0.03；χ2=6.907，P=0.009）；⑵

17、TLR2rs7656411的基因型頻率與等位基因頻率：三組間比較及典型PSM組與其對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≥0.05），但重型PSM組的基因型頻率與其對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.386，P=0.02，<0.05），重型PSM組57.8%患者具有基因型GT，而其對(duì)照組僅35.4%患者擁有基因型GT。
　　結(jié)論：
　　1.TLR2rs1339及rs7656411位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能與AIDS患者感染PM的易感性