TLR4在β2GPI免疫小鼠B細(xì)胞活化中的作用探討.pdf

1、研究目的：
　　高滴度抗β2GPI抗體(anti-β2-glycoprotein I antibody，anti-β2GPI Ab)是抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)患者血清中的獨(dú)立危險因素，增加了APS患者中血栓形成和反復(fù)流產(chǎn)的危險?？功?GPI抗體能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因子、粘附分子、腫瘤壞死因子等眾多細(xì)胞因子，從而引發(fā)炎癥、高凝等病理過程，參與APS的致病機(jī)制。本課題

2、組前期研究表明，TLR4能夠促進(jìn)β2GPI刺激的小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)的活化和成熟；有利于β2GPI免疫小鼠引起Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化。然而，對于TLR4在B細(xì)胞發(fā)揮的自身免疫反應(yīng)和APS相關(guān)抗體產(chǎn)生過程中的作用仍需進(jìn)一步的探究。本文在前期研究和相關(guān)文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上，通過比較TLR4缺陷組(C3H/HeJ)小鼠和TLR4正常組(C3H/HeN)小鼠經(jīng)

3、β2GPI免疫后抗體效價、B細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)以及相關(guān)炎癥分子和脾臟生發(fā)中心等差異，探討TLR4在β2GPI免疫小鼠脾臟B細(xì)胞活化中作用。
　　研究方法：
　　(1)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)：用于檢測經(jīng)β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/HeN小鼠(TLR4表達(dá)正常)和C3H/HeJ小鼠(TLR4表達(dá)缺陷)血清中的抗β2GPI抗體的效價。
　　(

4、2) HE染色：檢測分別經(jīng)β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/HeN小鼠(TLR4表達(dá)正常)和C3H/HeJ小鼠(TLR4表達(dá)缺陷)脾臟生發(fā)中心的個數(shù)及大小的變化。
　　(3)免疫組織化學(xué)：檢測分別經(jīng)β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/HeN小鼠(TLR4表達(dá)正常)和C3H/HeJ小鼠(TLR4表達(dá)缺陷)脾臟生發(fā)中心CD40L的表達(dá)。
　　(4)實(shí)時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，R

5、T-qPCR)：分別檢測經(jīng)β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/HeN小鼠(TLR4表達(dá)正常)和C3H/HeJ小鼠(TLR4表達(dá)缺陷)脾臟B細(xì)胞中IL-6和IL-10在 mRNA水平的表達(dá)。
　　(5)為進(jìn)一步探討TLR4在小鼠脾臟組織BAFF表達(dá)中的作用，本研究分別用RT-qPCR和Western blot檢測經(jīng)β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/HeN小鼠(TLR4表達(dá)正常)和C3H/HeJ小鼠(TLR4表達(dá)缺陷)脾臟組織中

6、BAFF的表達(dá)（mRNA和蛋白水平）。
　　(6)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)：為探究TLR4在β2GPI免疫的B細(xì)胞活化中的作用，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/HeN小鼠(TLR4表達(dá)正常)和C3H/HeJ小鼠(TLR4表達(dá)缺陷)脾臟B細(xì)胞中CD80、CD86、CD40及MHCII的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　(1)經(jīng)β2GPI免疫后，C3H/HeN小鼠和C3

7、H/HeJ小鼠血清中均出現(xiàn)高效價的抗β2GPI抗體，C3H/HeN小鼠的抗β2GPI抗體效價(>1:100,000)高于C3H/HeJ小鼠(1:100,000)，并且每個稀釋點(diǎn)的A值均高于C3H/HeJ小鼠。BSA免疫及NS處理組未見抗β2GPI抗體的產(chǎn)生。
　　(2)經(jīng)β2GPI刺激后的小鼠脾臟生發(fā)中心，較BSA刺激組和生理鹽水組更大更多，并且C3H/HeN小鼠的生發(fā)中心的數(shù)量和大小都高于C3H/HeJ小鼠。
　　(3)β

8、2GPI免疫的C3H/HeN小鼠脾臟組織中，BAFF在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)量均高于β2GPI免疫的C3H/HeJ小鼠。
　　(4)β2GPI刺激的C3H/HeN小鼠CD40和CD40L的表達(dá)明顯增高，與相同處理的C3H/HeJ小鼠有顯著差異（p<0.01, p<0.05）。
　　(5) C3H/HeN小鼠經(jīng)β2GPI刺激后， C3H/HeN小鼠脾臟B細(xì)胞(CD19+)中CD80、CD86和MHCII表達(dá)明顯升高，與相同

9、處理的C3H/HeJ小鼠有顯著差異（p<0.05）。
　　(6)在β2GPI誘導(dǎo)的C3H/HeN小鼠模型中，與相同處理的C3H/HeJ小鼠相比， C3H/HeN小鼠脾臟B細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥因子(IL-6和 IL-10)。
　　結(jié)論：
　　(1)β2GPI免疫小鼠產(chǎn)生特異性抗β2GPI抗體：β2GPI免疫的小鼠B細(xì)胞活化各項指標(biāo)均高于無關(guān)抗原蛋白(BSA)免疫的小鼠，并產(chǎn)生高效價的抗β2GPI抗體。
　　(2) T

10、LR4促進(jìn)抗β2GPI抗體的產(chǎn)生：與C3H/HeJ小鼠相比，β2GPI免疫的C3H/HeN小鼠產(chǎn)生更高效價的抗β2GPI抗體。
　　(3) TLR4促進(jìn)β2GPI誘導(dǎo)的小鼠B細(xì)胞活化：C3H/HeN小鼠經(jīng)β2GPI刺激后，脾臟生發(fā)中心的個數(shù)變多，面積變大；脾臟組織中BAFF的表達(dá)增強(qiáng)；B細(xì)胞共刺激分子(CD80，CD86，MHCII)和 B細(xì)胞炎癥因子(IL-6和 IL-10)的表達(dá)上調(diào)，且均高于β2GPI免疫的C3H/HeJ小鼠