TLR2在β2GPI-抗β2GPI復(fù)合物刺激小鼠腹腔巨噬細胞過程中的作用探討.pdf

1、研究目的：
　　抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）是以動脈或靜脈血栓形成、反復(fù)的妊娠并發(fā)癥為主要臨床表現(xiàn)，同時血清中持續(xù)存在抗磷脂抗體（antiphospholipid antibodies，APL）。其中，APL的靶抗原主要為血漿磷脂結(jié)合蛋白beta-2糖蛋白I（beta-2 glycoprotein I，β2GPI），抗β2GPI抗體是APS重要的致病性自身抗體。抗β2GPI抗體與膜結(jié)合

2、性β2GPI相互作用使單核細胞、血小板及內(nèi)皮細胞活化，其中Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）是細胞活化過程中重要的中間體。大量研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在β2GPI介導(dǎo)細胞活化、表達活性因子的過程中發(fā)揮著主要作用，但對TLR2是否參與細胞活化及其作用機制尚未明確。本論文重點探討TLR2是否參與介導(dǎo)β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物激活小鼠腹腔巨噬細胞，以及在此過程中TLR2與TLR4的相對重要性。
　　研究方法

3、：
　?。?）應(yīng)用流式細胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測巨噬細胞表面標志F4/80及CD11b，以鑒定分離的BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞的純度。
　　（2）采用β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物、Pam3CSK4（TLR2激動劑）、脂多糖（LPS）、β2GPI/抗β2GPI/TAK-242（TLR4阻斷劑）、β2GPI/抗β2GPI/anti-mTLR2-IgG（ TLR2阻斷劑）、β2GPI/抗β2GPI/TA

4、K-242/anti-mTLR2-IgG不同組合體外處理小鼠腹腔巨噬細胞，應(yīng)用 FCM及實時定量 PCR（ quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）分別檢測不同處理后的TLR2蛋白及mRNA表達。
　?。?） qRT-PCR和Western blot、細胞免疫熒光分別從mRNA和蛋白水平檢測不同處理組小鼠巨噬細胞IL-6、IL-1β及TNF-α的表達狀況，觀察TLR2能否介導(dǎo)β

5、2GPI/抗β2GPI復(fù)合物促進巨噬細胞表達炎性因子。
　?。?） qRT-PCR檢測TLR2阻斷劑和TLR4阻斷劑預(yù)處理后β2GPI/抗β2GPI誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞MCP-1和TF的mRNA表達，ELISA檢測MCP-1分泌水平，活性試劑盒檢測TF活性，觀察TLR2、TLR4阻斷劑對β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)的MCP-1及TF表達的干預(yù)作用。
　?。?） Western blot檢測β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物誘

6、導(dǎo)小鼠巨噬細胞NF-κB p65的表達及其磷酸化程度，利用TLR2阻斷劑和TLR4阻斷劑處理巨噬細胞，觀察TLR2是否通過NF-κB介導(dǎo)的信號通路激活小鼠巨噬細胞。
　　研究結(jié)果：
　?。?）流式細胞儀檢測的BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞表面標志F4/80、CD11b陽性率約為93％，分離的細胞純度高。
　?。?）β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物、Pam3CSK4、LPS均可增加小鼠腹腔巨噬細胞TLR2蛋白及mRNA表達水

7、平（p<0.05 vs control）， anti-mTLR2-IgG、TAK-242及二者聯(lián)合使用對TLR2蛋白表達的抑制效應(yīng)無統(tǒng)計學意義，而anti-mTLR2-IgG能抑制上述刺激物對TLR2 mRNA表達的促進效應(yīng)（p<0.05 vsβ2GPI/抗β2GPI），但弱于TAK-242的抑制效應(yīng)，anti-mTLR2-IgG與TAK-242聯(lián)合使用未顯示更強的抑制效應(yīng)。
　?。?）β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物、Pam3CS

8、K4、LPS能明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-αmRNA表達，該效應(yīng)可被anti-mTLR2-IgG抑制，但弱于TAK-242的抑制效應(yīng)，而二者合并使用并未顯示更強的抑制效應(yīng)，IL-6、IL-1β及TNF-α的蛋白表達水平也與其mRNA表達趨勢相似。
　　（4）小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物、Pam3CSK4及LPS體外刺激后 MCP-1、TF的mRNA水平顯著升高， anti-mT

9、LR2-IgG可抑制該作用，但TAK-242的抑制效應(yīng)更強，二者合并使用顯示最強的抑制效應(yīng)，MCP-1蛋白分泌水平及TF活性與其mRNA表達趨勢一致。
　　（5）巨噬細胞經(jīng)β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物、Pam3CSK4及LPS刺激后p-NF-κB p65表達增強，anti-mTLR2-IgG對β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物刺激巨噬細胞表達p-NF-κB p65的抑制效應(yīng)弱于TAK-242的抑制效應(yīng)，二者合并使用顯示抑制效應(yīng)最大。

10、
　　結(jié)論：
　?。?）β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物激活小鼠腹腔巨噬細胞過程中，TLR2表達增加，TLR2、TLR4阻斷劑可降低TLR2 mRNA表達水平，提示TLR2在抗磷脂綜合征病理過程中發(fā)揮一定作用。
　?。?）β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞炎癥因子、MCP-1及TF的表達，TLR2阻斷劑可抑制該效應(yīng)，而TLR4阻斷劑的抑制效應(yīng)更強，說明TLR2部分參與了β2GPI/抗β2GPI復(fù)合物激