microRNA調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細胞TLR2受體表達的作用機制研究.pdf

1、在本研究中，利用miRNA芯片技術(shù)測定COPD大鼠與正常大鼠肺泡巨噬細胞中差異表達的miRNA，通過生物信息學方法篩選可能參與TLR2受體調(diào)控的目標miRNA,采用雙熒光素酶的方法判斷兩者是否特異性結(jié)合，最后進行miRNA對COPD大鼠肺泡巨噬細胞TLR2受體表達影響調(diào)控機制研究，探索吸煙影響肺泡巨噬細胞免疫功能的分子機理。
　　第一章 COPD大鼠肺泡巨噬細胞差異表達的miRNA篩選
　　目的:利用miRNA芯片技術(shù)篩查C

2、OPD大鼠與正常大鼠肺泡巨噬細胞中差異表達的miRNA，為下一步確定調(diào)控TLR2受體的miRNA提供線索。
　　方法:60只雌性wistar大鼠隨機分為對照組、模型組。模型組采用單純熏香煙，1小時/次，2次/天，連續(xù)3月的方法造模。采用肺部CT、肺功能、肺組織病理學進行模型鑒定。肺泡巨噬細胞鑒定采用瑞氏染色與免疫熒光染色。收集COPD大鼠和正常大鼠肺泡巨噬細胞共3對。分離肺泡巨噬細胞提取總RNA，使用分光光度計測定RNA質(zhì)量，凝膠

3、電泳行RNA完整性鑒定。使用丹麥Exiqon公司試劑盒進行miRNA標記、芯片雜交、行微陣列基因芯片分析，比較兩組大鼠肺泡巨噬細胞miRNAs表達差異。
　　結(jié)果:模型組胸部CT、肺功能、肺病理均符合COPD表現(xiàn)。肺泡巨噬細胞瑞氏染色見細胞呈圓形或橢圓形，核大深染。CD68行免疫熒光染色見肺泡巨噬細胞熒光染色呈陽性。與對照組相比，模型組let-7b-3p與miR-675-5p顯著下調(diào);miR-200b-3p、miR-665、miR

4、-344b-1-3p、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-99b-5p、miR-129-1-3p、miR-3557-5p、miR-331-5p、miR-493-5p、miR-200a-3p11種miRNAs顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:1.單純煙熏法能成功復(fù)制COPD大鼠模型;2.COPD大鼠肺泡巨噬細胞與正常對照組之間存在明顯差異的miRNA表達。其中11個miRNA表達上調(diào)，2個miRNA表達下調(diào)。需要做進一步研究來探

5、索其功能。
　　第二章 調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細胞TLR2受體表達的miRNA預(yù)測
　　目的:篩查調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細胞TLR2受體表達的miRNA。
　　方法:采用mirbase，miranda和mirdb三個數(shù)據(jù)庫，分別對第一章獲得的13個miRNA進行靶基因預(yù)測，評估獲得的靶基因是否有TLR2。其次通過生物信息學方法為TLR2反向預(yù)測所有相關(guān)miRNA，最后通過NCBI網(wǎng)站檢索與TLR2相關(guān)的miRNA文

6、獻。將后兩者結(jié)果與芯片發(fā)現(xiàn)的所有miRNA(含無統(tǒng)計學差異的miRNA)進行比對。采用以上三種途徑獲得調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細胞TLR2受體的所有miRNA。最后為排除基因芯片假陽性或假陰性可能，采用實時熒光定量PCR(QPCR)的方法對其進行驗證，并對最后篩選的陽性結(jié)果，利用DAVID6.7系統(tǒng)進行靶基因Gene ontology(GO)及KEGG pathway分析。
　　結(jié)果:采用mirbase，miranda和mirdb

7、三個數(shù)據(jù)庫進行靶基因預(yù)測，共計表達12368個靶基因。僅miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-344b-1-3P的靶基因為TLR2。采用miRWalk數(shù)據(jù)庫，反向預(yù)測與TLR2基因有序列互補關(guān)系的miRNA，共找到13個miRNA，再將其與芯片發(fā)現(xiàn)的所有miRNA進行比對，結(jié)果提示Rno-miR-124-3P,rno-miR-363-5P, rno-miR-9a-3p在芯片中有表達。經(jīng)NCBI檢索，發(fā)現(xiàn)miR-125，miR-19a/b，miR-

8、146a的靶基因為TLR2。再將其與芯片發(fā)現(xiàn)的所有miRNA進行比對，結(jié)果提示rno-miR-125b-5p、rno-miR-19b-3p、miR-146a-5p在芯片中有表達。擴大樣本量，對經(jīng)以上三種方式發(fā)現(xiàn)的與TLR2相關(guān)的的7個miRNA進行qPCR驗證。7個miRNA中rno-miR344b-1-3p、rno-miR-125b-5p、miR-146a-5p差異有統(tǒng)計學意義。7個miRNA芯片與qPCR表達趨勢一致。miR-344

9、b-1-3p表達在芯片及qPCR結(jié)果中表達均上調(diào)且均有統(tǒng)計學差異，為首次報道。靶基因KEGG信號通路富集分析表明，miR-344b-1-3p的靶基因與TLR信號通路有關(guān)。
　　結(jié)論:1.實時熒光定量PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，基因芯片結(jié)果可靠;2.篩選miR-344b-1-3p調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細胞TLR2受體表達;3.miR-344b-1-3p靶基因pathway分析可見與TLR信號通路有關(guān)。
　　第三章 雙熒光素酶雙

10、報告系統(tǒng)驗證miR-344b-1-3p對肺泡巨噬細胞TLR2受體表達的調(diào)控
　　目的:驗證miR-344b-1-3p是否直接作用于TLR2-3'UTR。
　　方法:通過在線分析軟件對TLR2基因的miR-344b-1-3p結(jié)合位點做生物信息學分析，通過長引物序列拼接及點突變合成全序列TLR2-3'UTR。目的基因TLR2-3'UTR分別被正向及反向亞克隆至海腎螢光素酶翻譯終止密碼子下游多克隆位點，構(gòu)建含有TLR2-3'UTR

11、區(qū)域融合報告基因質(zhì)粒，并進行重組質(zhì)粒測序鑒定。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293細胞進行雙熒光素酶活性檢測。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建含TLR2-3'UTR區(qū)重組質(zhì)粒。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測提示與mimics對照組相比較，過表達的miRNA344b-1-3p mimics可顯著降低TLR2-3'UTR的報告基因活性(P=0.000481637)，而miRNA344b-1-3p inhibitor可顯著升高TLR2-3'UTR報告基因活性(P=0.000

12、428327)。初步確認miR-344b-1-3p調(diào)控TLR2基因。
　　結(jié)論:miR-344b-1-3p特異性調(diào)控TLR2。
　　第四章 miR-344b-1-3p對大鼠肺泡巨噬細胞TLR2受體表達及信號通路影響
　　目的:探討miR344b-1-3p對大鼠肺泡巨噬細胞TLR2受體表達及對信號通路和釋放炎癥因子的影響
　　方法:1.利用香煙煙霧提取物刺激NR8383細胞，試驗分為4組:A: NR8383細胞+C

13、SE(5％);B: NR8383細胞+CSE(10％);C: NR8383細胞+CSE(15％);D:空白對照組:NR8383細胞。造膜24h后進行流式細胞凋亡率檢測，采用qPCR方法檢測細胞中miRNA-344b-1-3P的表達。2.構(gòu)建大鼠miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒表達載體，將miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒轉(zhuǎn)染NR8383細胞。3.進行miR-344b-1-3P對大鼠肺泡巨噬細胞TLR

14、2受體表達及信號通路影響研究。實驗分為3組:A: NR8383細胞+10％ CSE+ miRNA慢病毒+Pam3CSK4;B:NR8383細胞+10％ CSE+miRNA空病毒+Pam3CSK4; C:NR8383細胞+10％CSE+Pam3CSK4。先采用10％CSE刺激NR8383細胞24小時，然后將miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒或者空病毒轉(zhuǎn)染NR8383細胞24小時，最后采用1 ug/mlPam3CSK4刺激

15、細胞1小時。收集細胞，采用流式細胞法檢測TLR2的表達;提取RNA采用QPCR檢測TLR2 mRNA的表達;收集蛋白采用WB檢測IRAK-1、IκBα、ERK的表達;收集上清液測定TNF-α、IL-1β、MIP-2、IL-10表達水平。
　　結(jié)果:1.空白對照組(NR8383細胞)凋亡率較低，隨著CSE濃度的增加，凋亡率呈升高的趨勢。兩兩相比較有顯著性差異(P＜0.05)。QPCR結(jié)果顯示隨著CSE濃度的增加，miR-344b-1

16、-3p表達增加，但是CSE濃度增加至15％時，miRNA表達量與10％CSE濃度結(jié)果無統(tǒng)計學意義。2.經(jīng)測序驗證，慢病毒載體構(gòu)建成功。3.將miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒轉(zhuǎn)染CSE刺激的NR8383細胞，經(jīng)Pam3CSK4刺激后，流式細胞檢測A組細胞表面LTR2受體表達較B、C組增高。4.Westernblotting檢測結(jié)果顯示A組的TLR2相關(guān)配體蛋白pIKBα、pIRAK-1、pERK表達較B、C組增高。用各

17、組條帶的配體蛋白灰度值比各組的GAPDH灰度值得到配體蛋白相對表達量，可見A組配體蛋白相對表達量高于B組及C組。5.3組培養(yǎng)上清液的濃度均增高。但A組TNF-α、IL-1β、MIP-2較B、C組高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但IL-10表達較對照組稍降低，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.CSE刺激NR8383細胞導致miR-344b-1-3p表達增高;2.miR344b-1-3p能調(diào)控TLR2表達及其相關(guān)