microRNA調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2受體表達(dá)的作用機(jī)制研究.pdf

1、在本研究中，利用miRNA芯片技術(shù)測(cè)定COPD大鼠與正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA，通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選可能參與TLR2受體調(diào)控的目標(biāo)miRNA,采用雙熒光素酶的方法判斷兩者是否特異性結(jié)合，最后進(jìn)行miRNA對(duì)COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2受體表達(dá)影響調(diào)控機(jī)制研究，探索吸煙影響肺泡巨噬細(xì)胞免疫功能的分子機(jī)理。
　　第一章 COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA篩選
　　目的:利用miRNA芯片技術(shù)篩查C

2、OPD大鼠與正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA，為下一步確定調(diào)控TLR2受體的miRNA提供線索。
　　方法:60只雌性wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組。模型組采用單純熏香煙，1小時(shí)/次，2次/天，連續(xù)3月的方法造模。采用肺部CT、肺功能、肺組織病理學(xué)進(jìn)行模型鑒定。肺泡巨噬細(xì)胞鑒定采用瑞氏染色與免疫熒光染色。收集COPD大鼠和正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞共3對(duì)。分離肺泡巨噬細(xì)胞提取總RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量，凝膠

3、電泳行RNA完整性鑒定。使用丹麥Exiqon公司試劑盒進(jìn)行miRNA標(biāo)記、芯片雜交、行微陣列基因芯片分析，比較兩組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞miRNAs表達(dá)差異。
　　結(jié)果:模型組胸部CT、肺功能、肺病理均符合COPD表現(xiàn)。肺泡巨噬細(xì)胞瑞氏染色見(jiàn)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核大深染。CD68行免疫熒光染色見(jiàn)肺泡巨噬細(xì)胞熒光染色呈陽(yáng)性。與對(duì)照組相比，模型組let-7b-3p與miR-675-5p顯著下調(diào);miR-200b-3p、miR-665、miR

4、-344b-1-3p、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-99b-5p、miR-129-1-3p、miR-3557-5p、miR-331-5p、miR-493-5p、miR-200a-3p11種miRNAs顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:1.單純煙熏法能成功復(fù)制COPD大鼠模型;2.COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞與正常對(duì)照組之間存在明顯差異的miRNA表達(dá)。其中11個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，2個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。需要做進(jìn)一步研究來(lái)探

5、索其功能。
　　第二章 調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2受體表達(dá)的miRNA預(yù)測(cè)
　　目的:篩查調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2受體表達(dá)的miRNA。
　　方法:采用mirbase，miranda和mirdb三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，分別對(duì)第一章獲得的13個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，評(píng)估獲得的靶基因是否有TLR2。其次通過(guò)生物信息學(xué)方法為TLR2反向預(yù)測(cè)所有相關(guān)miRNA，最后通過(guò)NCBI網(wǎng)站檢索與TLR2相關(guān)的miRNA文

6、獻(xiàn)。將后兩者結(jié)果與芯片發(fā)現(xiàn)的所有miRNA(含無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miRNA)進(jìn)行比對(duì)。采用以上三種途徑獲得調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2受體的所有miRNA。最后為排除基因芯片假陽(yáng)性或假陰性可能，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)的方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)最后篩選的陽(yáng)性結(jié)果，利用DAVID6.7系統(tǒng)進(jìn)行靶基因Gene ontology(GO)及KEGG pathway分析。
　　結(jié)果:采用mirbase，miranda和mirdb

7、三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共計(jì)表達(dá)12368個(gè)靶基因。僅miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-344b-1-3P的靶基因?yàn)門LR2。采用miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)，反向預(yù)測(cè)與TLR2基因有序列互補(bǔ)關(guān)系的miRNA，共找到13個(gè)miRNA，再將其與芯片發(fā)現(xiàn)的所有miRNA進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果提示Rno-miR-124-3P,rno-miR-363-5P, rno-miR-9a-3p在芯片中有表達(dá)。經(jīng)NCBI檢索，發(fā)現(xiàn)miR-125，miR-19a/b，miR-

8、146a的靶基因?yàn)門LR2。再將其與芯片發(fā)現(xiàn)的所有miRNA進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果提示rno-miR-125b-5p、rno-miR-19b-3p、miR-146a-5p在芯片中有表達(dá)。擴(kuò)大樣本量，對(duì)經(jīng)以上三種方式發(fā)現(xiàn)的與TLR2相關(guān)的的7個(gè)miRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。7個(gè)miRNA中rno-miR344b-1-3p、rno-miR-125b-5p、miR-146a-5p差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7個(gè)miRNA芯片與qPCR表達(dá)趨勢(shì)一致。miR-344

9、b-1-3p表達(dá)在芯片及qPCR結(jié)果中表達(dá)均上調(diào)且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，為首次報(bào)道。靶基因KEGG信號(hào)通路富集分析表明，miR-344b-1-3p的靶基因與TLR信號(hào)通路有關(guān)。
　　結(jié)論:1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，基因芯片結(jié)果可靠;2.篩選miR-344b-1-3p調(diào)控COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2受體表達(dá);3.miR-344b-1-3p靶基因pathway分析可見(jiàn)與TLR信號(hào)通路有關(guān)。
　　第三章 雙熒光素酶雙

10、報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-344b-1-3p對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞TLR2受體表達(dá)的調(diào)控
　　目的:驗(yàn)證miR-344b-1-3p是否直接作用于TLR2-3'UTR。
　　方法:通過(guò)在線分析軟件對(duì)TLR2基因的miR-344b-1-3p結(jié)合位點(diǎn)做生物信息學(xué)分析，通過(guò)長(zhǎng)引物序列拼接及點(diǎn)突變合成全序列TLR2-3'UTR。目的基因TLR2-3'UTR分別被正向及反向亞克隆至海腎螢光素酶翻譯終止密碼子下游多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建含有TLR2-3'UTR

11、區(qū)域融合報(bào)告基因質(zhì)粒，并進(jìn)行重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建含TLR2-3'UTR區(qū)重組質(zhì)粒。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)提示與mimics對(duì)照組相比較，過(guò)表達(dá)的miRNA344b-1-3p mimics可顯著降低TLR2-3'UTR的報(bào)告基因活性(P=0.000481637)，而miRNA344b-1-3p inhibitor可顯著升高TLR2-3'UTR報(bào)告基因活性(P=0.000

12、428327)。初步確認(rèn)miR-344b-1-3p調(diào)控TLR2基因。
　　結(jié)論:miR-344b-1-3p特異性調(diào)控TLR2。
　　第四章 miR-344b-1-3p對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2受體表達(dá)及信號(hào)通路影響
　　目的:探討miR344b-1-3p對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2受體表達(dá)及對(duì)信號(hào)通路和釋放炎癥因子的影響
　　方法:1.利用香煙煙霧提取物刺激NR8383細(xì)胞，試驗(yàn)分為4組:A: NR8383細(xì)胞+C

13、SE(5％);B: NR8383細(xì)胞+CSE(10％);C: NR8383細(xì)胞+CSE(15％);D:空白對(duì)照組:NR8383細(xì)胞。造膜24h后進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡率檢測(cè)，采用qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中miRNA-344b-1-3P的表達(dá)。2.構(gòu)建大鼠miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒表達(dá)載體，將miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞。3.進(jìn)行miR-344b-1-3P對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR

14、2受體表達(dá)及信號(hào)通路影響研究。實(shí)驗(yàn)分為3組:A: NR8383細(xì)胞+10％ CSE+ miRNA慢病毒+Pam3CSK4;B:NR8383細(xì)胞+10％ CSE+miRNA空病毒+Pam3CSK4; C:NR8383細(xì)胞+10％CSE+Pam3CSK4。先采用10％CSE刺激NR8383細(xì)胞24小時(shí)，然后將miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒或者空病毒轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞24小時(shí)，最后采用1 ug/mlPam3CSK4刺激

15、細(xì)胞1小時(shí)。收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞法檢測(cè)TLR2的表達(dá);提取RNA采用QPCR檢測(cè)TLR2 mRNA的表達(dá);收集蛋白采用WB檢測(cè)IRAK-1、IκBα、ERK的表達(dá);收集上清液測(cè)定TNF-α、IL-1β、MIP-2、IL-10表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.空白對(duì)照組(NR8383細(xì)胞)凋亡率較低，隨著CSE濃度的增加，凋亡率呈升高的趨勢(shì)。兩兩相比較有顯著性差異(P＜0.05)。QPCR結(jié)果顯示隨著CSE濃度的增加，miR-344b-1

16、-3p表達(dá)增加，但是CSE濃度增加至15％時(shí)，miRNA表達(dá)量與10％CSE濃度結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，慢病毒載體構(gòu)建成功。3.將miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒轉(zhuǎn)染CSE刺激的NR8383細(xì)胞，經(jīng)Pam3CSK4刺激后，流式細(xì)胞檢測(cè)A組細(xì)胞表面LTR2受體表達(dá)較B、C組增高。4.Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示A組的TLR2相關(guān)配體蛋白pIKBα、pIRAK-1、pERK表達(dá)較B、C組增高。用各

17、組條帶的配體蛋白灰度值比各組的GAPDH灰度值得到配體蛋白相對(duì)表達(dá)量，可見(jiàn)A組配體蛋白相對(duì)表達(dá)量高于B組及C組。5.3組培養(yǎng)上清液的濃度均增高。但A組TNF-α、IL-1β、MIP-2較B、C組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但I(xiàn)L-10表達(dá)較對(duì)照組稍降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.CSE刺激NR8383細(xì)胞導(dǎo)致miR-344b-1-3p表達(dá)增高;2.miR344b-1-3p能調(diào)控TLR2表達(dá)及其相關(guān)