大鼠肺泡巨噬細(xì)胞ERG鉀通道的表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、ERG(ether-a-go-go-related gene)鉀通道屬于電壓依賴性鉀離子通道，在人心肌和腦組織中高表達(dá)。越來越多的報(bào)道發(fā)現(xiàn)該通道與多種病理過程相關(guān)，如心律失常、腫瘤等，因此成為近年研究的熱點(diǎn)。新近的研究表明，骨髓來源的中樞系統(tǒng)單核-巨噬類細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞上存在ERG鉀通道。但是，ERG鉀通道是否存在于肺泡單核-巨噬細(xì)胞，若存在表達(dá)，其功能如何？與肺泡巨噬細(xì)胞的分泌及吞噬功能有何相關(guān)，目前均不清楚。探討肺泡巨噬細(xì)胞ERG

2、鉀通道的表達(dá)及功能，可為急性肺損傷機(jī)制的研究以及治療提供新的思路。 目的： 1.觀察肺泡巨噬細(xì)胞上是否有ERG鉀通道的表達(dá)。 2.初步探討ERG鉀通道與該細(xì)胞的分泌及吞噬功能是否相關(guān)。 方法： 1.大鼠肺泡巨噬細(xì)胞ERG鉀通道的表達(dá) 以大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383為研究對象，人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為陰性對照，采用RT-PCR方法檢測NR8383細(xì)胞erg鉀通道m(xù)RNA的表達(dá)，RT-PCR

3、產(chǎn)物進(jìn)行cDNA測序驗(yàn)證；免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western blot檢測NR8383細(xì)胞膜上ERG鉀通道蛋白的表達(dá)。 2.LPS刺激后大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383細(xì)胞erg mRNA和蛋白的表達(dá)變化 將培養(yǎng)24h的NR8383細(xì)胞系，加入LPS1ug/ml刺激(正常對照組細(xì)胞不加)，分別于3h、6h、12h、24h提取細(xì)胞總RNA和總蛋白采用RT-PCR法和Western-blot法檢測ERG鉀通道表達(dá)的變化。

4、 3.阻斷ERG鉀通道后大鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬和分泌功能的變化 將細(xì)胞分為正常對照組、4-AP阻斷組、TEA阻斷組、E-4031阻斷組。后三組先以相應(yīng)濃度(分別為ImM、mM、5μM)作用于細(xì)胞，阻斷鉀通道，2h后和正常對照組一起加入制備好的5％雞紅細(xì)胞，使雞紅細(xì)胞與大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的比例大概為100:1，置于培養(yǎng)箱中孵育th。之后用4％的多聚甲醛固定，再行姬姆薩染色，油鏡下觀察100個(gè)AM，計(jì)算吞噬率。吞噬率=已吞噬的巨噬細(xì)胞數(shù)

5、/巨噬細(xì)胞總數(shù)×100％。放射免疫法檢測阻斷ERG鉀通道后LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6的變化，將細(xì)胞分為PBS對照組、LPS組、4-AP+LPS組(非特異阻斷組)、TEA+LPS組(非特異阻斷組)、E-4031(1μM)+LPS組(特異阻斷組)、E-4031(5μM)+LPS組(特異阻斷組)；每組設(shè)6個(gè)孔。阻斷鉀通道2h后與LPS組一起加LPS1ug/ml刺激24h。24h后收集上清，采用放射免疫法檢測各組上清液中IL-6

6、的分泌量。 結(jié)果： 1.RT-PCR及測序結(jié)果表明，檢測到480bp左右的片段(與預(yù)期的一致)，表明NR8383細(xì)胞有erg mRNA表達(dá)，陰性對照A549細(xì)胞未見erg mRNA表達(dá)。經(jīng)cDNA測序進(jìn)一步證實(shí)其序列與數(shù)據(jù)庫中序列完全吻合。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，大量棕黃色陽性顆粒分布在NR8383細(xì)胞膜上，表明NR8383細(xì)胞膜上有ERG鉀通道蛋白表達(dá)，而陰性對照的A549細(xì)胞膜上未見棕黃色顆粒。Western blot

7、可以在NR8383細(xì)胞蛋白提取物中檢測到155kDa和135kDa兩條特異的ERG蛋白條帶，而陰性對照A549細(xì)胞未檢測到相應(yīng)條帶。 2.LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，ERG鉀通道m(xù)RNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化 (1)半定量RT-PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)LPS刺激后erg mRNA表達(dá)水平的改變，結(jié)果顯示：與未經(jīng)LPS刺激的AM細(xì)胞相比，經(jīng)LPS刺激后6h組erg mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，呈明顯時(shí)間依賴性增加，至所觀察的24h組

8、達(dá)到最高，為對照組的2倍(P<0.05)。 (2)通過Western blot檢測LPS刺激后不同時(shí)間ERG鉀通道蛋白表達(dá)水平改變，結(jié)果顯示：與未經(jīng)LPS刺激的AM細(xì)胞相比，LPS刺激6h后顯著增強(qiáng)，至所觀察的24h組達(dá)到最高，呈時(shí)間依賴性增加，為對照組的2倍(尸<0.05)。 3.ERG鉀通道對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬和分泌功能的影響 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與不加ERG鉀通道阻斷劑的對照組相比，加入特異

9、性阻斷劑E4031及非特異阻斷劑4AP和TEA的吞噬率顯著下降(P<0.01)，而特異阻斷組和非特異阻斷組之間的吞噬率無顯著差異，提示ERG鉀通道參與了AM細(xì)胞的吞噬功能。ERG鉀通道對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌功能的影響，先用特異阻斷劑和非特異阻斷劑阻斷鉀通道，再用LPS刺激AM一定時(shí)間后收集上清檢測IL-6的分泌功能，結(jié)果顯示：與未加阻斷劑的對照細(xì)胞相比，經(jīng)特異性阻斷劑E4031阻斷ERG鉀通道后，AM細(xì)胞分泌IL-6的量顯著下降

10、(P<0.01)，但小劑量(1μM)并無顯著影響；而使用非特異性阻斷劑4-AP和TEA阻斷后，同樣能夠抑制LPS刺激的IL-6的分泌，而二者之間沒有顯著差異。以上結(jié)果提示：ERG鉀通道參與了AM細(xì)胞的分泌功能。 結(jié)論： 1.大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383存在erg鉀通道m(xù)RNA，蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞膜；LPS刺激NR8383細(xì)胞后，erg鉀通道m(xù)RNA和蛋白水平呈時(shí)間依賴性升高。 2.ERG鉀通道可能與NR8383