衰老對(duì)大鼠小動(dòng)脈鉀通道功能和基因表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：衰老是心血管疾病發(fā)生的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，衰老過(guò)程中伴隨著各種血管疾病的發(fā)生。衰老引起的血管改變包括動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及血管反應(yīng)性的改變，而血管反應(yīng)性改變的機(jī)制很復(fù)雜，部分原因與離子通道的改變有關(guān)。有研究表明隨著年齡增長(zhǎng)，BKCa表達(dá)減弱，NO合成減少，從而影響血管舒縮功能的調(diào)節(jié)和正常血流動(dòng)力學(xué)的維持，使血管收縮性增加。血管平滑肌主要表達(dá)四種類型鉀通道，包括電壓依賴性鉀通道(Kv)，鈣激活鉀通道(KCa)，內(nèi)向整流鉀通道(

2、Kir)和ATP敏感性鉀通道(KATP)。鉀通道對(duì)調(diào)節(jié)興奮細(xì)胞的靜息電位，從而維持血管平滑肌張力有重要意義。許多藥物的舒血管作用與鉀通道有關(guān)。我們前期研究證實(shí)，牛磺酸對(duì)正常大鼠主動(dòng)脈的舒血管作用與四乙胺敏感鉀通道有關(guān)，?；撬釋?duì)胰島素抵抗大鼠的縮血管作用也和鉀通道有關(guān)。一些擴(kuò)血管藥物如尼可地爾，克羅卡林，吡那地爾和二氮嗪等可直接激活鉀通道舒張血管，而一些特異性的鉀通道阻斷劑如4—氨基吡啶可通過(guò)抑制Kv通道的活性收縮血管。在目前已知的血管平

3、滑肌鉀通道中，Kv通道是表達(dá)最多，種類最豐富的離子通道。由于血管部位及同一部位血管分支的不同，Kv通道的生物學(xué)活性也不同。Kv在控制靜息膜電位和小動(dòng)脈直徑方面起重要作用，因此分析正常情況下血管特異Kv通道的表達(dá)及功能非常重要，同樣如果Kv通道的表達(dá)及功能發(fā)生變化將會(huì)導(dǎo)致各種疾病。目前研究?jī)H局限于對(duì)Kv通道電流的宏觀研究，然而不同部位血管平滑肌發(fā)揮作用的Kv通道具體亞型的研究還不清楚。利用RT-PCR和Westernblot方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)K

4、v1.2和Kv1.5在大鼠腦動(dòng)脈，腸系膜動(dòng)脈，肺動(dòng)脈均有表達(dá)，這些資料表明Kv1通道，特別是Kv1.2和Kv1.5在介導(dǎo)血管舒縮功能方面起重要作用。 研究表明，隨年齡增加，大鼠主動(dòng)脈VSM上的KCa通道表達(dá)增加，膜片鉗實(shí)驗(yàn)證實(shí)KCa通道電流相應(yīng)增加，離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)動(dòng)脈環(huán)對(duì)KCa通道抑制劑的收縮反應(yīng)增強(qiáng)；而Kv通道則隨年齡增加無(wú)明顯變化。有研究表明，在老年大鼠，腦動(dòng)脈和肺動(dòng)脈KCa的表達(dá)無(wú)變化，冠狀動(dòng)脈則表達(dá)減少，對(duì)KCa通道抑制劑

5、的收縮反應(yīng)減弱。這說(shuō)明衰老對(duì)不同部位BKCa通道的影響不一樣。血管平滑肌表達(dá)多種鉀通道，那么衰老對(duì)其他鉀通道如Kv通道是否有影響目前報(bào)道很少。因此找出參與血管衰老的離子通道并闡明其作用機(jī)理非常重要。這將有助于我們理解血管衰老的進(jìn)程，對(duì)減緩血管衰老，提高生存質(zhì)量，降低老年人心血管疾病的發(fā)生有重要意義。 研究目的： (1)在觀察鉀通道阻斷劑對(duì)青年大鼠不同部位小動(dòng)脈收縮作用的基礎(chǔ)上，探討衰老對(duì)鉀通道阻斷劑在不同部位小動(dòng)脈的作用

6、的影響。 (2)在鉀通道阻斷劑對(duì)青年大鼠和老年大鼠小動(dòng)脈的作用有差異的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討Kv通道功能變化和Kv1.2和Kv1.5基因表達(dá)的關(guān)系，從而為研究老年人心血管疾病的發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)中鉀通道阻斷劑選用了四乙胺(Tetraethtylamine，TEA)，格列本脲(Glibenc lamide，Gli)，4—氨基吡啶(4—aminopyridine，4—AP)和氯化鋇(BaCl2)。小動(dòng)脈標(biāo)本我們選用了肺動(dòng)

7、脈、冠狀動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈、腎動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈。 研究方法： 1．離體微血管環(huán)實(shí)驗(yàn)方法。 大鼠脫臼處死后，立即取出腸系膜、腎臟、心臟、肺組織和大腦，浸入4℃的PSS液中。腸系膜及腎動(dòng)脈環(huán)的制備：將取出的腸系膜和腎臟組織浸入含有4℃PSS液的平皿，用大頭針固定動(dòng)脈主干和周圍組織，分離去除動(dòng)脈周圍的脂肪組織，選取動(dòng)脈的三級(jí)分支血管，剪取2mm左右的血管環(huán)。大腦中動(dòng)脈環(huán)的制備：鈍性分離大腦中動(dòng)脈，在靠近內(nèi)側(cè)處剪取2mm左

8、右的血管環(huán)。冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的制備：鈍性分離冠狀動(dòng)脈，在前降支處剪取2mm的血管環(huán)。肺動(dòng)脈環(huán)的制備：用鑷子輕輕剝離肺組織，找到與肺內(nèi)支氣管并行的小血管即為肺動(dòng)脈。沿肺動(dòng)脈剝離其二級(jí)分支血管，剪取2mm左右的血管環(huán)。將兩根直徑為40μm的鋼絲穿入管腔，固定血管環(huán)在Multi Myograph System-610M浴槽內(nèi)傳感器上。浴槽內(nèi)含有5mlPSS，持續(xù)通以100％O2，溫度控制在37℃，平衡60min后開始實(shí)驗(yàn)。平衡期間每隔15min

9、用預(yù)熱(37℃)的新鮮PSS液更換浴槽內(nèi)液體一次。血管環(huán)的張力變化通過(guò)DMT的換能系統(tǒng)采集，并用Chart5.4生物信號(hào)分析處理軟件記錄在微機(jī)上。為了使血管環(huán)處于最佳反應(yīng)狀態(tài)，分別調(diào)整腸系膜動(dòng)脈、腎動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、肺動(dòng)脈的跨壁壓，使其分別保持在相當(dāng)于100mmHg、80mmHg、80mmHg、80mmHg和80mmHg的基礎(chǔ)壓力狀態(tài)。為了檢測(cè)血管環(huán)在離體狀態(tài)下對(duì)血管活性物質(zhì)的反應(yīng)性，在開始正式實(shí)驗(yàn)之前，用80mmol/L的K

10、Cl預(yù)收縮，當(dāng)相鄰兩次刺激的收縮幅度差別不大于10％時(shí)，開始正式實(shí)驗(yàn)。制作BaCl2(10-5，3×10-5，10-4，3×10-4，10-3，3×10-3和10-2mol/L)，4—AP(10-3，3×10-5，10-4，3×10-4，10-3，3×10-3和10-2mol/L)，Gli(10-5，3×10-5，10-4，3×10-4，10-3，3×10-3和10-2mol/L)和TEA(10-5，3×10-5，10-4，3×10-4

11、，10-3，3×10-3，10-2和3×10-2mol/L)的濃度依賴性曲線。以80mmol/LKCl的收縮幅度為100％，計(jì)算藥物各濃度的收縮率。 2．RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法。 青年大鼠或老年大鼠脫臼處死后，立即取出腸系膜、腎臟、心臟、肺組織和大腦，浸入4℃的PSS溶液中。常規(guī)方法分離腸系膜動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、腎動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈和肺動(dòng)脈，將分離得到的動(dòng)脈組織放入液氮中保存。根據(jù)UNlQ-10柱式總RNA抽提試劑盒提供的說(shuō)明書

12、提取總RNA。用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過(guò)的無(wú)菌水溶解RNA，并將RNA放到-70℃保存。用OD值測(cè)定RNA的純度，以O(shè)D260/OD280＞1.7認(rèn)為RNA純度較好。然后根據(jù)TakaRa RNA PCRKit(AMV)Vet．3.0提供的方法進(jìn)行RT-PCR分析，實(shí)驗(yàn)用的引物有內(nèi)參基因GAPDH，目的基因Kv1.2和Kv1.5。首先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，提取得到的cDNA樣品用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為GAPDH29個(gè)循環(huán)，Kv1.

13、2共30個(gè)循環(huán)，Kv1.5共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(含0.5μg/ml溴化乙錠)，用天能凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描保存，進(jìn)行PCR條帶灰度掃描，以GAPDH作為內(nèi)參，作半定量分析。 結(jié)論： 1. 與青年大鼠相比，老年大鼠大腦中動(dòng)脈Kv通道阻斷劑對(duì)其收縮作用和Kv通道m(xù)RNA表達(dá)均有改變，老年大鼠Kv通道阻斷劑對(duì)大腦中動(dòng)脈收縮作用減弱，而Kv1.2和Kv1.5的mRNA表達(dá)卻增強(qiáng)。 2.