LPS調(diào)節(jié)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)CRH和UCN及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景與目的: 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasinghormone，CRH)是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸上游重要的神經(jīng)激素和調(diào)節(jié)因子之一，通過調(diào)節(jié)垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(arenocorticotrophichormone，ACTH)來控制糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)在腎上腺皮質(zhì)的分泌。Urocorti

2、n(UCN)則是近年發(fā)現(xiàn)的CRH結(jié)構(gòu)相關(guān)肽之一，它可與CRH受體家族的兩個(gè)主要成員CRH-R1和CRH-R2結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，CRH和UCN與免疫系統(tǒng)關(guān)系密切，不僅可通過調(diào)控HPA軸上GC的釋放來調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)；還可通過免疫細(xì)胞表面的CRH受體，發(fā)揮直接的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。哺乳動(dòng)物在正常生理及應(yīng)激條件下外周血CRH和UCN濃度均較低，但是在炎癥局部則存在較高水平的CRH和UCN。研究證實(shí)部分免疫細(xì)胞可表達(dá)CRH和UCN，其表

3、達(dá)水平在細(xì)胞免疫激活后會(huì)顯著上調(diào)。因此，目前普遍認(rèn)為參與直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能的外周CRH和UCN主要來源于炎癥反應(yīng)局部，通過自分泌和旁分泌方式發(fā)揮作用。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)啟動(dòng)細(xì)胞之一，參與了細(xì)胞和體液免疫過程，是重要的殺微生物效應(yīng)細(xì)胞，在感染等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是革蘭氏陰性菌感染時(shí)誘發(fā)炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)之一；它可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放TN

4、F-α等炎癥介質(zhì)，外源性CRH和UCN及其受體拮抗劑可顯著影響LPS的該作用效應(yīng)，并改變了內(nèi)毒素血癥小鼠的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸；LPS也可引起巨噬細(xì)胞表面的TLR4上調(diào)，而外源性CRH及UCN增強(qiáng)了LPS的該作用效應(yīng)。因此，CRH及UCN在LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞功能改變中發(fā)揮了重要作用；但是LPS作用于巨噬細(xì)胞后，內(nèi)源性CRH和UCN在巨噬細(xì)胞的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚。 因此，本課題旨在探討內(nèi)毒素作用后巨噬細(xì)胞表達(dá)CRH和UCN的規(guī)律

5、及其可能的表達(dá)調(diào)控通路。 材料與方法: 本課題在體外分離培養(yǎng)健康、成年(230～270g)Wistar大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR及ELISA技術(shù)進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究：(1)檢測(cè)正常培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中CRH和UCNmRNA及多肽含量，了解CRH及UCN在正常巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平；(2)用5ng/ml或25ng/ml佛波脂(TPA)處理培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，檢測(cè)處理后1h、2h、4h、8h細(xì)胞中CRH

6、及UCNmRNA及多肽含量變化，觀察CRH及UCN在活化腹腔巨噬細(xì)胞的表達(dá)規(guī)律；(3)用10ng/ml或100ng/mlLPS處理培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，體外模擬內(nèi)毒素血癥條件，檢測(cè)處理1h、2h、4h、8h時(shí)細(xì)胞中CRH及UCNmRNA及多肽含量變化，揭示內(nèi)毒素作用下巨噬細(xì)胞表達(dá)CRH及UCN的變化規(guī)律；(4)在加入LPS前30min分別用不同濃度的特異性阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞阻斷MAPK(mitogen-activatedproteink

7、inase，絲裂原活化蛋白激酶)信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶：10μmol/L、50μmol/L、100μmol/LPD98059阻斷細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignalregulatedkinase1/2，ERK1/2)，10μmol/L、50μmol/LSB203580阻斷c-JunN端蛋白激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)，10μmol/L、50μmol/LSP600125阻斷p38MAP

8、K；再用100ng/mlLPS處理細(xì)胞。在LPS刺激細(xì)胞4h時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞中CRHmRNA及多肽含量變化，探討MAPK信號(hào)通路在LPS調(diào)控巨噬細(xì)胞表達(dá)CRH中的作用。 主要結(jié)果: 1.在正常體外培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄一定水平的CRH及UCNmRNA(n=8)；并合成一定水平的CRH及UCN多肽，胞溶部分CRH多肽約為0.07±0.01ng/107cells(n=6)，UCN多肽約為1.0±0.50ng/107cel

9、ls(n=6)。 2.TPA呈時(shí)間依賴性上調(diào)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中CRH及UCN的表達(dá)。CRHmRNA水平在TPA處理細(xì)胞8h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01，n=8)，約為對(duì)照組的2.1倍，不同劑量組間無顯著差異；胞溶部分CRH多肽含量在25ng/mlTPA處理細(xì)胞8h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01，n=6)，約為對(duì)照組的2.0倍，為0.14+0.03ng/107cells。UCNmRNA水平在TPA處理細(xì)胞4h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01，n=8)，約

10、為對(duì)照組的2.1～2.3倍，不同劑量組間無顯著差異；胞溶部分UCN多肽含量在25ng/mlTPA處理細(xì)胞8h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01，n=6)，約為對(duì)照組的7.1.倍，為7.01±0.74ng/107cells。 3.LPS呈時(shí)間依賴性上調(diào)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中CHR及UCN的表達(dá)。CRHmRNA在LPS處理4h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01，n=8)，約為對(duì)照組的1.9～2.1倍，不同劑量組間無顯著差異；胞溶部分CRH多肽含量在濃度為100

11、ng/ml的LPS處理2h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01，n=6)，約為0.30±0.07ng/107cells，在8h時(shí)CRH多肽含量仍保持在0.15±0.07ng/107cells，約為對(duì)照組的2.1倍。UCNmRNA在LPS處理4h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01，n=8)，約為對(duì)照組的1.8～2.0倍，不同劑量組間無顯著差異；胞溶部分UCN多肽在100ng/mlLPS處理8h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01，n=6)，約為8.68±1.25ng/107ce

12、lls。 4.ERK1/2特異性阻斷劑：PD98059呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的CRH表達(dá)上調(diào)，其最大抑制效應(yīng)濃度為100μmol/L，抑制效率在mRNA水平達(dá)95％(n=8)，在多肽水平達(dá)90％(n=6)；c-JNK特異性阻斷劑SB203580、p38MAPK特異性阻斷劑SP600125也呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的CRH表達(dá)上調(diào)，其濃度為50μmol時(shí)抑制效應(yīng)在mRNA水平分別達(dá)41％、49％。 結(jié)論: 1

13、.正常腹腔巨噬細(xì)胞有CRH及UCN表達(dá)，提示它們?cè)诰S持正常巨噬細(xì)胞及其它免疫細(xì)胞功能中的潛在意義。 2.佛波脂促進(jìn)了CRH及UCN在巨噬細(xì)胞的表達(dá)；在內(nèi)毒素作用的巨噬細(xì)胞，CRH及UCN迅速上調(diào)并維持在較高水平，提示激活的巨噬細(xì)胞可能轉(zhuǎn)錄合成大量CRH和UCN，參與炎癥局部的病理生理調(diào)節(jié)活動(dòng)。 3.LPS上調(diào)CRH在腹腔巨噬細(xì)胞的表達(dá)主要依賴于MAPK信號(hào)通路，其中ERK1/2信號(hào)通路最為重要。 4.在正常及LP