miR-16調(diào)節(jié)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化及其對(duì)CD4+T細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的:
　　本研究擬探討miR-16對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞M1/M2極化的調(diào)控作用及其對(duì)CD4+T細(xì)胞功能的影響，為抗腫瘤免疫治療提供新的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.miR-16對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用
　　1.1 以100ng/ml IFN-γ及20 ng/ml LPS刺激C57BL/6小鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞48h將其誘導(dǎo)成M1型巨噬細(xì)胞模型，以20 ng/ml IL-4刺激C57BL/6小鼠腹腔來源

2、巨噬細(xì)胞48h將其誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞模型。我們選取了CD16/32、IL-12和iNOS作為M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，CD206，Dectin-1和IL-10作為M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞CD16/32、CD206和Dectin-1的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10和IL-12的濃度，Griess法測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞iNOS的活性水平，以驗(yàn)證兩型巨噬細(xì)胞的成功獲得。
　　1.2 我們

3、用慢病毒感染小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞和IL-4誘導(dǎo)形成的M2型巨噬細(xì)胞，使其過表達(dá)miR-16，分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞CD16/32、CD206和Dectin-1的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10和IL-12的分泌，Griess法測(cè)定腹腔巨噬細(xì)胞iNOS的活性水平，以探究miR-16對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的表型和功能的影響。
　　2.miR-16影響M2型巨噬細(xì)胞極化后對(duì)CD4+T細(xì)胞功能的影響及其可能機(jī)制

4、
　　2.1 采用M2型巨噬細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)的方法，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞表面早期活化標(biāo)志CD69的表達(dá)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2和IFN-γ的分泌，以研究miR-16影響M2型巨噬細(xì)胞表型和功能后對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞功能的影響。
　　2.2 利用Mirbase、Targetscans、PicTar等基因預(yù)測(cè)軟件查找miR-16可能的潛在靶基因，以探索miR-16影響M2型巨噬細(xì)胞極化的可能機(jī)制。

5、
　　2.3 將慢病毒介導(dǎo)的miR-16導(dǎo)入IL-4誘導(dǎo)形成的M2型巨噬細(xì)胞使其過表達(dá)miR-16，利用Western Blot檢測(cè)PD-L1蛋白的表達(dá)情況，以驗(yàn)證miR-16是否通過調(diào)控PD-L1蛋白的表達(dá)而影響腹腔巨噬細(xì)胞的極化。
　　結(jié)果:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)表明，miR-16促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞的極化，抑制M2型巨噬細(xì)胞的極化。
　　1.1 經(jīng)IFN-γ和LPS處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞CD16/32表達(dá)上調(diào)，I

6、L-12產(chǎn)生明顯增加，iNOS的活性水平增加，符合M1型巨噬細(xì)胞的特點(diǎn);經(jīng)IL-4處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞CD206和Dectin-1表達(dá)上調(diào)，IL-10產(chǎn)生明顯增加，符合M2型巨噬細(xì)胞特點(diǎn)。
　　1.2 慢病毒介導(dǎo)的miR-16感染小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞后，CD16/32表達(dá)增加，CD206和Dectin-1表達(dá)無明顯變化，iNOS的活性水平增加，IL-12分泌增加，IL-10變化不明顯，表現(xiàn)出類似M1型巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)。
　　

7、1.3 慢病毒介導(dǎo)的miR-16感染IL-4誘導(dǎo)形成的M2型巨噬細(xì)胞后，CD16/32表達(dá)上調(diào)，CD206，Dectin-1表達(dá)下調(diào)，iNOS的活性水平增加，IL-12產(chǎn)生增加，IL-10分泌降低，其特點(diǎn)傾向于M1型巨噬細(xì)胞。
　　2.miR-16抑制M2型巨噬細(xì)胞的表型和功能，進(jìn)而促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的功能，其可能通過影響PD-L1蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
　　2.1 在體外共培養(yǎng)體系中，與對(duì)照組相比，與過表達(dá)miR-16的M2型