腸道免疫系統(tǒng)中巨噬細胞和CD4+T細胞之間的相互作用及機制.pdf

1、研究目的：
　　腸道是機體內(nèi)環(huán)境與外界直接交流的主要界面。腸道黏膜免疫系統(tǒng)是機體抵御腸道病原體感染的第一道防線。小腸固有層是腸道免疫系統(tǒng)主要的效應位點，其中包含大量的巨噬細胞、CD4+T細胞和樹突狀細胞等，在早期抵抗腸道病原菌過程中起著關鍵作用。其中巨噬細胞通過產(chǎn)生活性氧中間體和活性氮中間體等物質(zhì)，在清除胞內(nèi)寄生菌的過程中發(fā)揮關鍵的殺菌作用。CD4+T細胞可以通過分泌IFN-γ促進巨噬細胞的活化，但在腸道黏膜免疫系統(tǒng)抵抗外來病原體

2、感染的過程中，二者是否存在相互調(diào)節(jié)及其在抗感染中的作用和機制，目前研究尚少。
　　本研究以鼠傷寒沙門氏菌腸道感染模型，觀察小腸固有層巨噬細胞和CD4+T細胞的活化及其在抗細菌感染中的作用，并探討二者間是否存在相互調(diào)節(jié)作用及機制，將為腸道感染及炎癥修復等疾病提供新的治療策略和思路。
　　方法:
　　首先，我們采用灌胃的方法建立了腸道感染鼠傷寒沙門氏菌動物模型;運用流式細胞術檢測小鼠小腸固有層淋巴細胞各亞群的比例、數(shù)量和活

3、化的變化。
　　其次，為了研究腸道巨噬細胞和CD4+T細胞在抵抗外來病原菌入侵時是否存在相互調(diào)節(jié)作用，我們分別利用特異性清除抗體清除小鼠CD4+T細胞、利用Cl2MDP脂質(zhì)體清除巨噬細胞，觀察清除CD4+T細胞對感染小鼠巨噬細胞數(shù)量和活化的變化及清除巨噬細胞對感染小鼠CD4+T細胞的數(shù)量和活化的變化。
　　再次，我們分離小鼠腹腔巨噬細胞，體外感染鼠傷寒沙門氏菌后，與CD4+T細胞共孵育，同時加入α-乳糖特異性阻斷galect

4、in-9與Tim-3的結(jié)合，然后觀察巨噬細胞的載菌量、活化、分泌細胞因子水平和CD4+T細胞的活化、分泌細胞因子、凋亡的變化。
　　最后，我們運用Westernblot技術檢測小鼠腹腔巨噬細胞體外感染鼠傷寒沙門氏菌后炎性小體NLRP3和NLRC4以及caspase-1的蛋白表達水平，利用Westernblot、ELISA和FACS等多種技術檢測IL-1β的表達變化。另外，我們觀察了加入IL-1β中和抗體后感染的巨噬細胞與CD4+T

5、細胞共孵育后的載菌量變化及外加IL-1β對感染后的小鼠腹腔巨噬細胞載菌量和galectin-9表達的影響。初步探究了galectin-9和Tim-3信號通路在巨噬細胞和CD4+T細胞之間的相互作用中所發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:
　　1.小腸固有層F4/80+CD11c+巨噬細胞和CD4+T細胞在感染后數(shù)量和活化均明顯增加
　　我們我們首先建立了鼠傷寒沙門氏菌腸道感染模型，并應用流式細胞術檢測了感染第1、3、5、7天小腸固

6、有層部位各淋巴細胞亞群的比例、數(shù)量和活化的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著感染天數(shù)的增加，小腸固有層F4/80+CD11b+巨噬細胞的比例有所增加。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)一群表型為F4/80+CD11c+的巨噬細胞，其在固有層中的比例和數(shù)量的增加更為明顯。同時我們也觀察到了CD4+T細胞和CD8+T細胞在感染后數(shù)量增加，但僅有CD4+T細胞活化明顯增強。提示這兩種細胞在清除鼠傷寒沙門氏菌的過程中發(fā)揮重要作用。
　　2.清除CD4+T細胞明顯削弱小腸

7、固有層巨噬細胞的活化
　　我們通過抗體清除實驗清除小鼠CD4+T細胞，然后比較清除組和未清除組感染后小腸固有層巨噬細胞的數(shù)量及活化的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清除CD4+T細胞小鼠感染后肝、脾、MLN組織載菌量高于未清除組，腸道巨噬細胞的活化和IL-1β的分泌均低于未清除組。
　　3.清除巨噬細胞明顯削弱小腸固有層CD4+T細胞的活化
　　我們利用Cl2MDP脂質(zhì)體清除小鼠巨噬細胞，然后比較清除組和未清除組感染后小腸固有層CD4

8、+T細胞的數(shù)量及活化的變化。我們發(fā)現(xiàn)，清除組小鼠感染后肝、脾、MLN組織載菌量高于未清除組，腸道CD4+T細胞的活化和細胞因子分泌均低于未清除組。
　　4.α-乳糖阻斷galectin-9-Tim-3的結(jié)合影響巨噬細胞的殺菌功能
　　為了驗證galectin-9和Tim-3信號通路參與了腸道巨噬細胞和CD4+T細胞之間的相互作用，我們在巨噬細胞和CD4+T細胞體外共孵育實驗中加入不同濃度α-乳糖以阻斷galectin-9與T

9、im-3的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)隨著α-乳糖濃度的升高巨噬細胞的載菌量和IL-1β的分泌均明顯下降;而CD4+T細胞的活化沒有受到明顯影響，但其凋亡隨著α-乳糖濃度的升高而降低。提示galectin-9和Tim-3信號通路參與了腸道巨噬細胞和CD4+T細胞之間的相互作用，而且這一信號通路促進巨噬細胞的殺菌功能、觸發(fā)CD4+T細胞的凋亡。
　　5.巨噬細胞感染鼠傷寒沙門氏菌后細胞因子和炎性小體及其下游信號分子的表達上調(diào)
　　對小鼠腹腔巨噬

10、細胞體外感染鼠傷寒沙門氏菌后各種指標的檢測證明，巨噬細胞感染后IL-1β的分泌量增多，炎性小體NLRC4和NLRP3及caspase-1的表達量增加，并且自感染6小時即明顯增加，至18小時達到高峰，24小時略有下降。
　　6.α-乳糖阻斷galectin-9-Tim-3的結(jié)合影響巨噬細胞炎性小體NLRC4和NLRP3及caspase-1的表達
　　在巨噬細胞和CD4+T細胞共孵育體系中加入不同濃度α-乳糖，檢測巨噬細胞中炎性

11、小體及其下游信號分子的表達。結(jié)果顯示，感染鼠傷寒沙門氏菌可以激活炎性小體的表達;再加入CD4+T細胞共孵育，可進一步提高炎性小體的表達水平;當加入不同濃度的α-乳糖后，隨著乳糖濃度的升高炎性小體的表達呈現(xiàn)逐步下降的趨勢。說明galectin-9-Tim-3的結(jié)合可以促進巨噬細胞表達炎性小體及其下游信號分子。
　　7.IL-1β促進巨噬細胞的殺菌能力和galectin-9的表達
　　小鼠腹腔巨噬細胞體外感染鼠傷寒沙門氏菌后加入

12、不同濃度IL-1β刺激，觀察巨噬細胞載菌量的變化。發(fā)現(xiàn)隨著IL-1β濃度的增加，巨噬細胞的載菌量逐漸下降。感染的巨噬細胞與CD4+T細胞共孵育，同時加入IL-1β中和抗體，發(fā)現(xiàn)中和抗體的加入明顯削弱了巨噬細胞清除細菌的能力。而加入10ng/mL的IL-1β培養(yǎng)后，F(xiàn)ACS檢測巨噬細胞表達galectin-9的變化。結(jié)果顯示，IL-1β可以促進巨噬細胞galectin-9的表達，而且培養(yǎng)18小時較12小時時增加更加明顯。
　　結(jié)論:

13、
　　1.小腸固有層F4/80+CD11c+巨噬細胞和CD4+T細胞在腸道免疫系統(tǒng)清除胞內(nèi)菌的過程中發(fā)揮重要作用。
　　2.小腸固有層巨噬細胞和CD4+T細胞在清除病原菌過程中存在相互作用。
　　3.Galectin-9-Tim-3信號通路參與了腸道巨噬細胞和CD4+T細胞之間的相互作用。
　　4.Galectin-9-Tim-3信號通路可以增強巨噬細胞炎性小體的表達及IL-1β的成熟和分泌。
　　5.IL