CD4+T細(xì)胞亞群在肥胖、2型糖尿病及其并發(fā)癥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、當(dāng)前肥胖及2型糖尿病發(fā)病呈現(xiàn)爆炸式增長的趨勢，并已成為世界性公共衛(wèi)生問題。系統(tǒng)性慢性低度炎癥為肥胖及2型糖尿病的共同特征。該病理狀態(tài)已越來越多地被證實(shí)為肥胖、2型糖尿病的發(fā)病及伴隨并發(fā)癥風(fēng)險的核心環(huán)節(jié)。然而慢性炎癥上游的細(xì)胞和分子機(jī)制還未明朗。當(dāng)前，代謝負(fù)荷-免疫失衡在肥胖及2型糖尿病中作用的研究逐漸得到重視。事實(shí)上，除了后面帶來的一長列代謝疾病和并發(fā)癥，肥胖還常常被報道顯著增加很多自身免疫病及炎癥性疾病的發(fā)病風(fēng)險，如哮喘、風(fēng)濕性疾病、

2、炎癥性腸病等。這些流行病學(xué)證據(jù)更強(qiáng)烈地暗示代謝營養(yǎng)負(fù)荷和免疫失衡、炎癥狀態(tài)之間的潛在聯(lián)系。
　　在肥胖及2型糖尿病慢性炎癥的基礎(chǔ)研究中，人們最早發(fā)現(xiàn)的明顯改變是脂肪組織中巨噬細(xì)胞的浸潤及相關(guān)炎性細(xì)胞因子表達(dá)上升，因此，固有免疫系統(tǒng)一度是學(xué)者的關(guān)注熱點(diǎn)。而直到最近人們才開始把研究焦點(diǎn)集中到固有免疫系統(tǒng)紊亂的上游。WuH及Kintscher等分別發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了T細(xì)胞浸潤先于巨噬細(xì)胞出現(xiàn)。繼而Nishimura.S等進(jìn)一步證實(shí)T細(xì)胞在脂肪

3、組織炎癥的起始階段即已介入，并與該炎癥介導(dǎo)的糖耐量受損和胰島素抵抗進(jìn)展變化相一致。以上均提示T細(xì)胞在肥胖及2型糖尿病慢性炎癥的上游啟動和維持過程中發(fā)揮重要的作用。其中，CD4+T淋巴細(xì)胞可分化為Th1、Th2、Th17、Treg以及最新發(fā)現(xiàn)的Th22等細(xì)胞亞群，其在協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞相互作用、維持免疫穩(wěn)態(tài)中起核心作用，又被稱作輔助性T(Thelper，Th)細(xì)胞。近年臨床免疫學(xué)進(jìn)展表明，Th細(xì)胞亞群的失衡是引起免疫失衡并造成慢性炎癥狀態(tài)的關(guān)鍵

4、。促炎性Th細(xì)胞亞群包括Th1、Th17等比例上調(diào)或功能亢進(jìn)，而抗炎性的Th2、Treg等比例下降或功能受損是促發(fā)慢性炎癥狀態(tài)的直接扳機(jī)點(diǎn)。前人研究揭示肥胖及代謝綜合征患者及動物模型中均存在著脂肪組織及外周血Treg比例的下調(diào)。然而隨著證據(jù)的積累，人們發(fā)現(xiàn)單從Treg出發(fā)并不能很好的解釋免疫失衡與肥胖及其相關(guān)代謝疾病的關(guān)系。與前人相左，vanderWeerdK等甚至報道了肥胖患者外周血Treg及Th2等抗炎細(xì)胞數(shù)目較正常對照增加。但是，

5、他們的研究對象排除了肥胖伴發(fā)代謝異常的患者，僅觀察到了少數(shù)單純肥胖而無代謝異常（如胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)）患者的外周血。由于在自然人群中，肥胖往往伴隨血糖、血脂等代謝異常，或合并高血壓、心血管疾病等。但有相當(dāng)一部分人群，肥胖但代謝特征正常，研究者將這種情況稱為“良性肥胖”或“代謝健康肥胖”。因此，上述現(xiàn)象也有可能說明這種抗炎變化是肥胖發(fā)生后的一種代償，更完善的研究設(shè)計是必須的。而肥胖伴發(fā)胰島素抵抗乃至糖尿病患者中是否存在免疫平衡狀態(tài)的失代償，以

6、及這種失代償改變對肥胖向相關(guān)代謝疾病轉(zhuǎn)歸的作用的研究顯得更為迫切。更重要地，除了數(shù)量上的平衡，肥胖及2型糖尿病患者中Treg細(xì)胞亞群及促炎性Th細(xì)胞亞群功能狀態(tài)的改變需要被給予更多的重視。
　　糖尿病帶來的最大的痛苦和負(fù)擔(dān)即種種并發(fā)癥，而心血管并發(fā)癥更以高發(fā)病率、高致死率而排在各種并發(fā)癥的前面。其中糖尿病與冠心病的關(guān)聯(lián)性如此之大，以至于學(xué)者明確提出“糖尿病為冠心病的等危癥”這一概念。由于慢性炎癥已被證實(shí)為肥胖、2型糖尿病及其相關(guān)并

7、發(fā)癥尤其是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的“共同土壤”。曾經(jīng)有學(xué)者推測促炎性的Th細(xì)胞亞群改變和急性心梗、變異性心絞痛等的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)，但是目前尚缺乏系統(tǒng)研究可以證實(shí)這些Th細(xì)胞亞群改變對心血管事件發(fā)生風(fēng)險具有獨(dú)立顯著的貢獻(xiàn)。特別地，糖尿病本身就有促炎性Th細(xì)胞水平上調(diào)的基線改變。系統(tǒng)研究糖尿病患者中這些異常過度反應(yīng)的Th細(xì)胞的與各項(xiàng)臨床指標(biāo)包括并發(fā)癥的關(guān)系，不僅為肥胖及2型糖尿病本身的發(fā)病機(jī)制提供新的視角，也將為代謝相關(guān)并發(fā)癥如心血管疾病的發(fā)病

8、機(jī)制及干預(yù)治療的探討帶來新思路。
　　我們的前期探索綜合提示Th22細(xì)胞很可能是肥胖及2型糖尿病中的一個重要參與者。作為Th細(xì)胞家庭的新成員，Th22細(xì)胞亞群因其主要效應(yīng)細(xì)胞因子IL-22的受體主要分布在外周組織而非免疫細(xì)胞上，被認(rèn)為是直接向周圍組織傳遞炎性效應(yīng)信號的關(guān)鍵細(xì)胞亞群。最新進(jìn)展已揭示Th22及IL-22在多種炎癥相關(guān)疾病中扮演重要角色。Th22的主要效應(yīng)因子IL-22是IL-10細(xì)胞因子家族的重要成員，其通過與由IL-

9、10β及IL-22Rα兩個亞單位組成的異二聚體復(fù)合物受體結(jié)合而引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)。IL-22已成為慢性炎癥性疾病的一個重要干預(yù)靶點(diǎn)。然而其具體效應(yīng)卻因?yàn)榻M織特異性或其它炎性因子環(huán)境的差異而截然不同。如在銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中IL-22表現(xiàn)為促炎和損傷效應(yīng)，而在病毒性肝炎等疾病中其又能發(fā)揮對肝細(xì)胞的保護(hù)和促增殖作用。已有文獻(xiàn)報道IL-22受體在胰島中豐富表達(dá)。而與我們在2型糖尿病患者中的觀察一致，也有研究發(fā)現(xiàn)Th22在以β細(xì)胞特異性免疫損傷

10、和功能耗竭為特征的1型糖尿病中也是上調(diào)的。因此，本研究將基于前期臨床發(fā)現(xiàn)進(jìn)而首先探索Th22的主要效應(yīng)細(xì)胞因子IL-22以及TNF-α對體外胰島β細(xì)胞細(xì)胞活性及增殖能力的影響。
　　目的:
　　1.系統(tǒng)對比研究肥胖及2型糖尿病患者外周血Th1/Th2，Th17/Treg及Th22等輔助性T細(xì)胞亞群的數(shù)目及比例、相關(guān)細(xì)胞因子譜及其分化相關(guān)特異轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的變化，探討各亞群比例與胰島素抵抗及β細(xì)胞功能損傷兩大核心病理過程的關(guān)

11、系;進(jìn)一步探討患者Treg與Tresp細(xì)胞功能狀態(tài)的改變;
　　2.研究各促炎性輔助T淋巴細(xì)胞亞群對2型糖尿病患者心血管并發(fā)癥發(fā)病風(fēng)險的貢獻(xiàn);
　　3.探索Th22細(xì)胞主要效應(yīng)細(xì)胞因子IL-22和TNF-α對胰島β細(xì)胞損傷和增殖的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.研究對象:目的1入選人群及分組包括A健康對照組(CTL)，B代謝健康肥胖組(BMI≥30kg/m2，MHO)，C2型糖尿病組(T2D)3組;目的2研究

12、對象為伴或不伴冠心病的2型糖尿病患者;所有觀察對象均經(jīng)過嚴(yán)格入選及排除標(biāo)準(zhǔn)篩查。
　　2.受試者研究指標(biāo):
　　A.所有患者需完善病史采集、空腹胰島素及超敏C反應(yīng)蛋白測定以及入院三大常規(guī)及生化檢驗(yàn)等各項(xiàng)臨床指標(biāo)的檢查;
　　B.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血CD4+T細(xì)胞及Th1、Th2、Th17、Treg、Th22各細(xì)胞亞群的比例;
　　C.Flowcytomix或ELISA法測定受試者血漿相關(guān)細(xì)胞因子水平;

13、>　　D.通過實(shí)時定量PCR測定外周血單個核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子及關(guān)鍵功能蛋白的mRNA表達(dá)水平;
　　E.免疫磁珠細(xì)胞分選法分選得到Treg和Tresp細(xì)胞，通過磁珠擴(kuò)增法觀察其活性與增殖能力，利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)分析Tresp的細(xì)胞毒性作用及Treg的抑制功能。
　　3.流行病學(xué)及統(tǒng)計學(xué)分析:采取病例對照研究設(shè)計，t檢驗(yàn)、方差分析或秩和檢驗(yàn)等比較各組指標(biāo)有無差異;Person或Spearman檢驗(yàn)及偏相關(guān)分析探索指標(biāo)間相關(guān)

14、性;采用logistic回歸分析校正混雜變量計算優(yōu)勢比，分析各指標(biāo)對疾病的貢獻(xiàn)值;分類變量繪制R×C表卡方檢驗(yàn)等計算各指標(biāo)的疾病風(fēng)險預(yù)測價值等。
　　4.IL-22效應(yīng)通路的探討:分別用TNF-α、IL-22及二者聯(lián)合刺激INS-1細(xì)胞，采用CKK-8及LDH法聯(lián)合檢測INS-1細(xì)胞的損傷和增殖，Westernblot檢測STAT-3通路活化水平（pSTAT-3/STAT-3比值）;利用siRNA干擾技術(shù)分別敲除IL-22Rα及下

15、游STAT-3，探討IL-22R-STAT-3通路在β細(xì)胞炎性損傷和增殖中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.MHO及T2D外周血各促炎Th細(xì)胞亞群占總CD4+T細(xì)胞的比例均有不同程度的升高:
　　A.其中更以Th22細(xì)胞的水平改變?yōu)橹琓2D患者的Th22上調(diào)與MHO患者相比仍有顯著意義[CTLvsMHOvsT2D:(1.18±0.06％，n=28)vs(1.88±0.10％,n=30)vs(2.247±0.10％,n=8

16、9)，P＜0.0001)];
　　B.Th1比例在T2D患者(median，17.73％;range，4.652-42.52％)顯著高于MHO組(median，15.23％;range，2.297-27.56％)（*P＜0.05）和健康對照(median，11.17％;range，4.724-25.70％)(*P＜0.0001)，而在MHO組的上調(diào)不具統(tǒng)計學(xué)顯著性;
　　C.Th17比例在MHO(median，1.815％;

17、range，1.10-3.21％)及T2D患者中(median，2.08％;range，0.48-5.25％)顯著上升(*P＜0.0001)，而MHO與T2D兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異
　　D.升高的各Th細(xì)胞亞群之間均存在正相關(guān)關(guān)系(*P＜0.001);
　　E.升高的Th22是肥胖發(fā)病的風(fēng)險因素，同時也是MHO向T2D轉(zhuǎn)歸的風(fēng)險因素（OR值分別為54.47，8.636）。
　　2.與細(xì)胞比例一致，患者血漿中各細(xì)胞亞群對應(yīng)

18、的炎性細(xì)胞因子存在不同水平的上調(diào):
　　A.IL-22血漿濃度在T2D(median，47.56pg/ml;range，30.55-76.89pg/ml)明顯高于健康對照組(median，36.33pg/ml;range，31.93-40.62pg/ml)乃至MHO患者(median,36.65pg/ml;range,29.52-55.70pg/ml)(*P＜0.0001)，而MHO與對照組相比差別不顯著(P＞0.05).

19、　　B.IFN-γ水平在MHO(median,1.76pg/ml;range,0.33-4.10pg/ml)(*P＜0.0001)及T2D(median,1.08pg/ml;range,0.36-3.43pg/ml)(*P＜0.05)患者中均上調(diào)，而兩組患者間差別不顯著.
　　C.IL-17水平在T2D患者(median，3.84pg/ml;range，0.81-7.78pg/ml)明顯高于CTLs(median，2.06pg/m

20、l;range，0.81-3.04pg/ml)甚至MHO患者(median，1.91pg/ml;range，0.89-5.11pg/ml)(*P＜0.0001).肥胖與對照組之間差別不顯著。
　　3.T2D及MHO患者PBMC中Th22特異性轉(zhuǎn)錄因子AHRmRNA顯著上調(diào)(分別是健康對照的2.23和2.91倍(*P＜0.05)，而外周血中促進(jìn)Th22方向極化的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平均上調(diào)。升高的AHR表達(dá)水平和TNF-α

21、、IL-6水平與Th22細(xì)胞的比例均呈顯著正相關(guān)(*P＜0.05)。
　　4.T2D及MHO患者外周血Tresp細(xì)胞的體外增殖能力和細(xì)胞毒性作用顯著增強(qiáng)，Treg體外抑制功能明顯降低。
　　5.外周血Th1、Th17、Th22比例和絕對數(shù)目的上升均對T2D患者中冠心病發(fā)病的風(fēng)險具有一定貢獻(xiàn):
　　A.糖尿病合并心血管并發(fā)癥患者三種促炎Th細(xì)胞亞群比例及絕對值甚至比無心血管并發(fā)癥的患者還要高（*P＜0.05）;升高的Th

22、亞群水平與炎性標(biāo)志物（同樣也是心血管事件風(fēng)險重要指標(biāo)）C反應(yīng)蛋白存在正相關(guān)關(guān)系，其中Th1和Th22的絕對值與比例與CRP水平的相關(guān)性具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(相關(guān)系數(shù)分別為0.249，0.257和0.303，0.454;*P＜0.05)。
　　B.利用logistic回歸分析校正年齡、性別、糖尿病病程等混雜因素后，Th1，Th17andTh22細(xì)胞比例對冠心病患病率的貢獻(xiàn)仍有顯著意義，其中Th22細(xì)胞比例（每上升1％）和絕對數(shù)（每μl

23、外周血中增加1個）的增加帶來的風(fēng)險貢獻(xiàn)值最為突出（OR分別為41364.708和1.159）(*P＜0.0001)。
　　C.通過Stepwiselogisticregression模型分析各Th亞群改變在所有冠心病危險因素中的重要性和獨(dú)立性，Th22絕對數(shù)僅跟在CRP、LDL-C、胰島素抵抗指數(shù)之后進(jìn)入最終模型。
　　D.相關(guān)性分析表明Th1、Th17與Th22絕對數(shù)均與動脈粥樣硬化預(yù)測指數(shù)(AIP)呈顯著正相關(guān)（*P＜0

24、.05），而僅Th22的比例與AIP的相關(guān)性有統(tǒng)計意義。進(jìn)一步R×C表分類變量分析示T2D患者中Th1比例或Th22的絕對數(shù)目中度升高（超過中位數(shù)）即可分別帶來4.451倍的冠心病患病風(fēng)險，其各自陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值同為79.63％和56.36％。
　　6.體外實(shí)驗(yàn)示IL-22處理INS-1細(xì)胞具有刺激其增殖和凋亡的雙重作用:
　　A.單純IL-22刺激促進(jìn)INS-1增殖，但對INS-1也有損傷作用;
　　B.單純T

25、NF-α刺激劑量對INS-1有劑量依賴的損傷作用;
　　C.TNF-α與IL-22合用時，在單獨(dú)刺激效應(yīng)劑量的半量時即可引起INS-1的顯著損傷;
　　D.干擾IL-RI或STAT-3表達(dá)均可阻止IL-22的細(xì)胞損傷和促增殖作用。
　　結(jié)論:
　　1.MHO患者即出現(xiàn)了外周血促炎性Th細(xì)胞亞群比例的異常上調(diào)及功能亢進(jìn)，而T2D患者該異常進(jìn)一步加重;新發(fā)現(xiàn)的Th22細(xì)胞亞群很可能在外周胰島素抵抗及β細(xì)胞功能損傷過程

26、中均扮演了重要角色;而PBMC中Th22轉(zhuǎn)錄因子AHR基因的上調(diào)可能部分解釋了Th22極化的，細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的升高同樣驅(qū)動患者外周血Th0向Th22極化;
　　2.除了Th1/Th2及Th17/Treg等比例平衡上的改變，肥胖及T2D患者Tresp細(xì)胞增殖能力顯著亢進(jìn)，而Treg細(xì)胞抑制功能則相對顯著受損;
　　3.進(jìn)一步異常升高的Th1、Th17和Th22均對T2D患者中心血管事件發(fā)生風(fēng)險的增加具有顯著貢獻(xiàn)，

27、該作用可能通過促進(jìn)慢性炎癥損傷而實(shí)現(xiàn);而外周血Th22細(xì)胞的數(shù)目對冠心病的發(fā)生發(fā)展具有最顯著的貢獻(xiàn)，且其作用可能獨(dú)立于CRP、血脂、胰島素抵抗等已知風(fēng)險因素;Th1亞群比例和Th22細(xì)胞數(shù)目對心血管事件可能具有潛在預(yù)測價值;
　　4.Th22細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞因子IL-22和TNF-α均對INS-1細(xì)胞具有殺傷作用，IL-22對INS-1同時具有促增殖作用，然而在與TNF-α聯(lián)合作用時以細(xì)胞毒性作用為主導(dǎo);IL-22對胰島細(xì)胞的作